凋亡抑制蛋白基因dsRNA转基因烟草方式探究.doc

凋亡抑制蛋白基因dsRNA转基因烟草方式探究 　烟粉虱Bemisia　tabaci（Gennadius）广泛分布于全球除南极洲外的各大洲，是热带、亚热带及相邻温带地区棉花、蔬菜和园林花卉等植物及大田作物的主要害虫之一[1]。它不仅取食寄主植物汁液，而且能够传播100多种病毒，分泌大量蜜露诱发煤污病影响光合作用[2-3]。烟粉虱也是科技界有史以来唯一被冠以“超级害虫”（superbug）的昆虫，近20年来给许多国家的农业造成严重的经济损失。烟粉虱在我国广大地区已暴发成灾并造成严重危害，近年来烟粉虱传播的双生病毒在山东、浙江、江苏等地区给番茄等蔬菜造成毁灭性的危害[4]。现在控制烟粉虱的主要手段为化学防治。化学农药的大量使用，不仅导致农药残留，破坏了环境与生态系统平衡，而且导致烟粉虱抗药性逐年增强。目前，传统的烟粉虱防治策略难以满足农业生产的需要，急需新的防控手段。 　RNA干扰（RNA　interference，RNAi）是由与靶基因序列同源的双链RNA（dsRNA）介导的特异性基因表达沉默现象，是生物的一种古老并且进化上高度保守的基因表达调节机制。Fire等[5]（1998）首次发现将dsRNA注入线虫Caenorhabditis　elegans可以导致同源基因的mRNA降解，从而导致转录后基因沉默，并将这种由dsRNA引发的抑制特定基因表达的现象称为RNAi。随后，RNAi的基础研究和应用研究迅速成为当前生命科学中的热点领域之一。例如，Zhu等[6]（2008）利用RNAi技术研究几丁质酶（Chitinase）样蛋白在赤拟谷盗Tribolium　castaneum中的功能，注射TcCHT5　dsRNA至幼虫，TcCHT5转录水平降低，使蛹不能完全羽化；RNAi沉默TcCHT10表达，可以阻止胚胎孵化、幼虫蜕皮和成虫蜕变，证明TcCHT10蛋白在昆虫发育过程中具有重要的作用。RNAi应用于农作物遗传改良进行精准抗虫已成为近年来研究的一个热点[7-8]。Chen等[9]（2008）注射合成的dsRNA/siRNA到甜菜夜蛾Spodoptera　exigua的四龄幼虫诱导几丁质合成酶（chitin　synthase　gene　A，CHSA）沉默，结果发现大多异常的幼虫不能蜕皮，或进入下一期的幼虫明显小于正常幼虫，并且气管上壁不能统一扩张，明显提高了异常发生率。这些研究提示了应用RNAi防治害虫的可能。 　在前期研究中，我们发现凋亡抑制蛋白（Inhibitor　of　Apoptosis　Protein，IAP）的dsRNA能够导致烟粉虱死亡。IAP是指能够保护特定的细胞抵抗一系列刺激原诱导，从而避免细胞凋亡发生的一类蛋白，它是一类高度保守的抗凋亡基因家族表达产物。IAP结合并抑制caspase的活性，从而阻止细胞死亡，甚至可以调节细胞周期和信号转导[10-12]。为了研究IAP基因的dsRNA诱导RNAi对烟粉虱的影响，利用RNAi防治烟粉虱，笔者构建了IAP　dsRNA转基因烟草表达载体。 1　　　　材料和方法 　1.1　　　　材　料 　1.1.1　　　　菌株和质粒　　　大肠杆菌Trans109、pMD18-T 　载体购于TaKaRa宝生物工程（大连）有限公司，pUC-RNAi载体和pCAMBIA-2300-35S表达载体由山东省农业科学院高新技术研究中心王兴军研究员提供。 　1.1.2　　　　烟粉虱　　　　B型和Q型烟粉虱Bemisia　tabaci（Gennadius）由本项目组培养于人工气候箱中，在扶桑（Hibiscus　rosa-siensis）植株上维持种群，温度为（26plusmn;2）　deg;C，相对湿度为70%，光周期为L∶D=16∶8。 　1.1.3　　　　工具酶和主要试剂　　　　BamHⅠ、BglⅡ、PstⅠ、SalⅠ和XhoⅠ内切酶购于TaKaRa公司，DNA　Ligation　Kit、RNAisoTM　Plus、DL2000TM　DNA　Marker购于TaKaRa公司；RQ1　DNAase购于Promega公司；RevertAidTM　First　Strand　cDNA　Synthesis　Kit购于MBI　Fermentas公司；EasyTaq　DNA酶、EasyPureTM　Quick　Gel　Extraction　Kit、EasyPureTM　Plasmid　MiniPrep　Kit购于北京全式金生物技术有限公司，dNTP购于上海生工生物工程有限公司；其他化学试剂均为AR级产品。 毕业论文 　1.1.4　　　　主要试验仪器　　　　TaKaRa　PCR　Thermal　Cycler　Dice？誖PCR仪，Sigma　3K30高速低温离心机，Techcomp　CT14D高速离心机，AlphaI