糖化血红蛋白测定的标准化.ppt

第三十章 层析法测定生化物质 * 第*页 第*页 第二节 糖化血红蛋白测定 一、糖化血红蛋白测定方法概述 临床实验室糖化血红蛋白的测定方法有多种，但按其理化性质可分为二大类：①根据糖化与非糖化血红蛋白所带电荷的差异，区分A0和A1c，如离子交换层析和电泳法；②根据糖化与非糖化血红蛋白的结构差异：利用血红蛋白上糖化基团的结构特点，采用亲和层析和免疫法及酶法。目前最常用的是基于高效液相的检测方法，其精密度高、重复性好且操作简单。 第*页 第*页 二、离子交换层析法 原理是基于不同的糖化血红蛋白带电荷不同进行分离，糖化导致的糖化血红蛋白分子表面阳离子丢失，采用阳离子交换树脂进行分离。用偏酸缓冲液处理阳离子交换树脂,使之带负电荷。而HbA带正电荷较多，吸附率较高。在低离子强度和中性pH的洗脱液条件下, HbA1c几乎不带正电荷,从而在HbA前先洗脱,再用高浓度洗脱液将HbA洗出,测定洗脱液中的HbA1c占总Hb的百分数。 第*页 二、离子交换层析法 该法可最初建立了手工微柱法应用于临床实验室，后来发展成专用的全自动离子交换高效液相色谱(HPLC)法仪器，能分离HbA1a、HbA1b和HbA1c和HbA0，并在临床上应用已较成熟。因此，美国、瑞典及日本等国家将其作为HbA1c标准化参考系统的参考方法。 第*页 第*页 三、亲和层析法 该法可最初建立了手工微柱法应用于临床实验室，后来发展成专用的全自动离子交换高效液相色谱(HPLC)法仪器，能分离HbA1a、HbA1b和HbA1c和HbA0，并在临床上应用已较成熟。因此，美国、瑞典及日本等国家将其作为HbA1c标准化参考系统的参考方法。 第*页 第*页 四、免疫法 免疫法是利用抗原、抗体反应的原理设计。以糖化血红蛋白作为抗原，HbA1c的β链N-末端提供了一个容易被抗体识别的抗原表位，可以采用单克隆抗体特异性识别糖化血红蛋β链N一末端最后3～4个氨基酸组成的抗原表位，以糖化血红蛋白为标准，结合比色或比浊法，测定HbA1c的含量，再测定血红蛋白的含量，最后计算出HbA1c占总血红蛋白的百分数。 第*页 第*页 五、糖化血红蛋白的测定方法性能评价 （一）离子交换层析法 离子交换高效液相层析法是糖化血红蛋白测定的参考方法。易受HbA1c前体（Schiff碱）、胎儿血红蛋白( HbF)、衍生血红蛋白（甲酰化或乙酰化血红蛋白）及变异血红蛋白（HbS、HbC、HbE和HbD）等因素的干扰，尤其pH和温度对对结果有较大的影响，易产生偏差。环境温度规定的标准温度为22℃，冬天应将柱子置于22℃温箱内操作。 第*页 五、糖化血红蛋白的测定方法性能评价 （一）离子交换层析法 经过不断的改进，HPLC法克服了pH、温度及其他一些影响因素，减少了对HbA1c峰的干扰，对HbA1c的分离可以达到临床需求的精密度和稳定性。因此美国、瑞典及日本等国家将其作为HbA1c标准化参考系统的参考方法。目前的离子交换HPLC法有很好的精密度，变异系数CV在3%以内。 采用手工微柱法时，因操作方法和微柱的质量不易控制,易产生误差。 第*页 第*页 五、糖化血红蛋白的测定方法性能评价 （二）亲和层析法 本法操作简单、快速、价廉,特异性强。对经翻译以后修饰的血红蛋白和病理血红蛋白的影响相对不敏感,不受异常血红蛋白的干扰, 对血标本储存的时间也不象离子交换法那样严格。但检测结果为糖化血红蛋白总量（HbA1）, 不能分离出HbA1c。亲和层析HPLC法精密度较好，室内变异系数CV在2%以内。 第*页 （三）免疫法 免疫法可溯源到离子交换HPLC法，但高浓度样本测定结果偏低，可能的原因：一是由于此法的特异性比目前的一些方法高，二是由于试剂盒抗体浓度不能达到相关高度，需要稀释样本。在研究发现变异血红蛋白可影响测定结果。因此，此方法用来判断血糖水平，不可用于变异血红蛋白的研究。 第*页 五、糖化血红蛋白的测定方法性能评价 第*页 （四）HbA1c检测的优势 1．患者无需空腹，可以任意时间采血，不受进餐的影响。 2．较静脉血糖更能反映长期的血糖情况，不受短期饮食、运动等生活方式变化的影响。 3．HbA1c实验室检测方法正在开始标准化。 4．一些非血糖因素影响HbA1c而引起的误差少见，如血红蛋白病。 第*页 五、糖化血红蛋白的测定方法性能评价 第*页 （五）HbA1c的局限性 HbA1c检测结果对调整治疗后的评估存在“延迟效应”，不能精确反映患者低血糖的风险，也不能反映血糖波动的特征。 第*页 五、糖化血红蛋白的测定方法性能评价 第*页 第*页 五、糖化血红蛋白的测定方法性能评价 （六）影响HbA1c检测结果的因素