链霉菌室实验操册（2003年）.docVIP

链霉菌室实验操作手册（2003年） 第一章 培养基 抗生素 生长因子 3 常用抗生素及其使用浓度 3 LB（Luria-Bertani）培养基 3 LA 3 基本培养基（MM） 3 R5（1L）链霉菌原生质体转化时用 4 YEME(酵母膏-麦芽膏培养基) 1L（液体培养链霉菌） 4 TSBY （1L）（液体培养链霉菌） 4 MS培养基 5 2CMY培养基（用于井岗的接合转移） 5 YMS培养基（阿维，井岗产孢） 5 YD培养基 5 生长因子补充物的使用浓度 5 第二章 DNA基本操作 7 大肠杆菌质粒的抽提 7 酶连反应 7 DNA片段凝胶回收 7 DNA纯化 9 E.coil总DNA的提取 9 链霉菌质粒DNA的小量提取（还需改进） 10 去磷酸化处理（详见分子克隆实验指南以及Takara的CIAP使用说明） 10 AT克隆（详见说明书） 10 Southern Blot 11 第三章 PCR及相关技术 13 PCR 13 PCR重组（详见《PCR技术实验指南》p429 重叠延伸技术） 14 PCR定点诱变（DpnI法） 14 第四章 基因片段转移技术 15 大肠杆菌CaCl2法制备感受态细胞及DNA转化 15 DNA转化 15 大肠杆菌质粒的快速检测 15 接合转移（详见英文《手册》249页） 16 链霉菌原生质体的制备 16 链霉菌原生质体的转化 17 PCR-Targeting技术中E.coli电转化感受态的制备及电转化 17 第五章 RNA操作技术 19 链霉菌总RNA的抽提 19 链霉菌的RT-PCR（promega RT kit） 19 第六章 蛋白质基本操作技术 21 SDS，考马斯亮蓝染色 21 大肠杆菌可溶性蛋白表达及抽提（用于由IPTG诱导的表达体系）： 21 链霉菌总蛋白抽提： 22 大肠杆菌目标蛋白的诱导及总蛋白检测（含T7表达系统如BL21菌株中的pET系列表达体系）： 22 Western Blot 23 第七章 遗传作图相关技术 25 链霉菌孢子悬液的制备 25 链霉菌中NF的证明 25 孢子杂交 25 在遗传图谱上两个标记基因之间定位新的基因 25 第八章 其他技术 27 链霉菌菌种保藏 27 检测链霉菌淀粉酶的活性 27 第一章 培养基 抗生素 生长因子 常用抗生素及其使用浓度 抗生素 英文名称及缩写 抗性基因 贮藏液浓度(mg/ml) 使用终浓度（μg/ml） 链霉菌 大肠杆菌 MM 2CM YEME LA或LB 氨苄青霉素 氯霉素 潮霉素 卡那霉素 壮观霉素 链霉素 硫链丝菌素 红霉素 阿泊拉霉素 Ampicillin, Amp Chloramphenicol, Cml Hygromycin, Hyg Kanamycin, Km Spectinomycin, Spc Streptomycin, Str Thiostrepton, Thio Erythomycin, Ery Apramycin, Am bla cat hyg aac或aph aadA str tsr ermE aac(3)IV 100 25(无水乙醇配) 50 25 50 50 25(DMSO配) 100 50 R 10 10 2? 50 10 5 100 10 R － 25 50 50 25 10 － 50 R － － － 50 － 2.5 － 50 50-100 25 50 50 50 25 不敏感 20 30-50 *– 表示无记录或不能使用，贮存液除特别说明外均用无菌水配制 *此表仅供参考！！！ *R表示不敏感 *Km 和Am有交叉抗性，所以同时具有这两种抗性基因时应适当提高抗生素的量，并作好对照。 *Hyg易见光分解，应用锡箔纸包好。 *有些抗生素需要在低盐的环境（如DNA培养基）下筛选效率较高，如Hyg, Km, Vio LB（Luria-Bertani）培养基 胰蛋白胨 10g， 酵母抽提物 5g， NaCl 5g，葡萄糖 1g， 蒸馏水加至 1000ml， pH7.3左右（灭菌后第一次用时还要调一次） LA LB中加入终浓度为1.5-2%的琼脂粉(不同的琼脂加的量不同，如青岛琼脂大概需1.5%，而华美的需要2%)。 ＊做蓝白斑筛选时不加葡萄糖 基本培养基（MM） 溶液：L-天冬酰胺 0.5g， K2HPO4 0.5g, MgSO4·7H2O 0.2g, FeSO4·7H2O 0.01g, 蒸馏水至 1000ml 将每250ml溶液分装到装有2.5g琼脂的500ml三角瓶中，灭菌，使用时每瓶加入50％葡萄糖（8磅灭菌）5ml，调pH7.0。 配置MM的琼脂有lab agar、Ice agar(IA) R5（1L）链霉菌原生质体转化时用 蔗糖