基因的分离与鉴定-西北师范大学.pptVIP

第六章 基因克隆的一般策略 基因克隆的四个基本的步骤 真核基因克隆的基本步骤 第一节 DNA 克隆片段的产生与分离６.１.１基因组DNA的片段化 6.1.2 DNA片段的大小分部 6.1.3 编码目的基因的克隆片段的富集 第二节　重组体DNA分子的构建及导入受体细胞 6.2 .1 重组体构建途径 6.2 .2 重组体向宿主细胞的导入 重组体DNA分子的转化或转染 第三节　重组体筛选与鉴定 第四节 目的基因的分离方案 １．基因文库技术克隆基因 （l）、DNA文库的构建 （2）cDNA文库 ④载体引导合成法 ⑤置换法 2.互补作用基因克隆 3、基因定位克隆 染色体步移 基于 PCR的分子标记，它又分为两类： RAPD （Random amplified polymorphic DNA） AFLP （Amplified polymorphic Length DNA） DAF（DNA amplification fingerprinting） SSCP（Single strand confirmational polymorphism） 小卫星DNA（Minisatellite DNA） 微卫星DNA（Microsatellite DNA）或SSR（Simple sequence repeat） ISSR（Inter simple sequence repeat） AP-PCR（Arbitrary primer PCR） 主要有SCAR（Sequence characterized amplified region） STS (Sequence tagged site) AFLP（Amplified fragment length polymorphism） AFLP是先酶切，再用特殊设计的引物进行扩增 CAPS（Cleaved amplified polymorphic sequence） CAPS是先扩增，再酶切扩增片段 微卫星DNA Microsatellite，MS/Simple Sequence Repeat,SSR 短的，简单的串联重复序列； 基元是1-6个碱基(有的定义为1-5个碱基)； 广泛存在于真核细胞整个基因组的不同位置上； 高度多态性(微卫星DNA长度的多态性) ； 微卫星DNA两端多是高度保守的单拷贝序列； 共显性标记。 4、mRNA差别显示技术 ５、差减杂交：扣除文库 ６、抑制消减杂交:DDRT-PCR、SSH 7、插入突变技术 考考你： cDNA基因克隆有什么优越性？ 返回本章首页 第一步：分离细胞总RNA，然后从中纯化出主要含mRNA的分部。第二步：合成第一链cDNA。 构建cDNA文库的步骤 第三步：将mRNA－DNA杂交分子转变为双链cDNA分子。 第四步：重组、转化 第五步：标记、编号、保存 返回本章首页 如：将大肠杆菌DNA的克隆片段“库”，分别导入某种大肠杆菌营养缺陷型受体细胞。然后将此受体细胞涂布在一种缺少该菌株所需要的底物的基本培养基上。只有获得了营养缺陷型互补基因的受体细胞才会长成转化子菌落。 … … · · · · OK 返回本章首页 RFLP:限制性片段长度多态性标记（Restriction fragment length polymorphism, 简称RFLP标记）、 A A B B 返回本章首页 返回本章首页 RFLP用于基因遗传分析 两基因连锁时，同一个体的两基因生态型一定一致 两基因不连锁时，同一个体的两基因生态型不一定一致 返回本章首页 返回本章首页 位点特异的PCR标记方法 多位点标记方法 基于PCR技术的DNA扩增方法 其它标记 返回本章首页 PCR与酶切相结合的方法 返回本章首页 返回本章首页 AATG 7 repeats 8 repeats AATG AATG 引物 引物 引物 引物 STR分型（第二代DNA分型技术） 返回本章首页 不同的个体有不同的DNA指纹图 母亲 儿子 男性1 男性2 男性3 利用DNA指纹图进行亲子鉴定 返回本章首页 逆转录反应 荧光标记差异显示PCR 分离差异显示片段 回收差异条带　 差异条带的再扩增 返回本章首页 用两种遗传背景相同或大致相同而功能不同的材料提取mRNA或cDNA , 用大大过量不含目的基因的一方与含有目的基因的试验方进行杂交，选择性地去除两部分共同基因杂交形成的复合物，将含有目的基因的未杂交部分收集后装入载体形成文库。 返回本章首页 * 基因工程 * 基因工程