大肠杆菌无痕重组的策略与应用.pdfVIP

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１４，３４（８）：８８９６ ＤＯＩ：１０．１３５２３／ｊ．ｃｂ 大肠杆菌无痕重组的策略与应用 １ １ １ １ １，２ 刘陆罡 　纪晓俊 　沈梦秋 　童颖佳 　黄　和 （１南京工业大学生物与制药工程学院　南京　２１１８１６　２南京工业大学材料化学工程国家重点实验室　南京　２１０００９） 摘要　Ｒｅｄ同源重组技术发展迅速，已经广泛应用于大肠杆菌基因的敲除、插入与替换。与传统 的ＤＮＡ有痕重组技术相比，基于Ｒｅｄ重组原理的ＤＮＡ无痕重组技术，能够更为精确、快速、高效 地修饰大肠杆菌基因组中的目标基因，且在基因组中不残留任何外源片段，因此不会影响后续的 基因操作与基因表达。从Ｒｅｄ同源重组的原理出发，简要综述了近年来在大肠杆菌中广泛使用 的无痕重组技术的原理及操作策略，并对比分析了各种方法的优势与不足；同时，还介绍了ＤＮＡ 无痕重组技术在大肠杆菌基因修饰中的应用情况。 关键词　Ｒｅｄ重组　无痕重组　策略　应用 中图分类号　Ｑ７８９ 　　１９９１年，美国科学家Ｂａｉｌｅｙ首次提出了“Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）作为最简单的模式生物，以其背景清 （ ［１］ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ”的 概 念 。代 谢 工 程 （Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ 晰、生长快速、易于操作等优势，在代谢工程等研究领 ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）亦称途径工程（Ｐａｔｈｗａｙｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ），即根 域备受青睐，同时，它也是用于大宗化学品生产的主要 据已知的细胞代谢网络信息对细胞代谢途径进行合理 微生物之一，以大肠杆菌作为开发新型基因重组技术 设计，结合分子生物学、基因工程等技术手段对细胞代 的微生物平台最为合适。综上所述，本文主要介绍了 谢途径进行修饰与改造，从而有目的、有理性地完善或 几种基于Ｒｅｄ重组原理的无痕重组技术，并对其原理、 改变细胞原有的代谢特性，使细胞高效地积累目标产 操作策略，以及在大肠杆菌基因修饰中的应用进行了 ［１］ 物 。作为代谢工程最主要的技术手段之一，基因重 简要阐述。 组技术的兴起与发展，使人们能够以不断更新的微生 物遗传信息为基础，对微生物进行遗传修饰与改造，在 １　Ｒｅｄ同源重组原理 深入研究特定基因生物学功能的同时，进行基因的敲 　　早期的大肠杆菌基因同源重组是利用 ＲｅｃＡ同源 除、插入或替换，从而强化目标产物的积累。 重组系统进行的，该系统是细菌的内源性同源重组系 　　在重组工程领域，Ｒｅｄ同源重组技术被广泛地应 ［２］ 统，由ＲｅｃＡ和ＲｅｃＢＣＤ等一系列酶组成 。然而，以 用。利用该技术改造或修饰微生物基因组，改变其自 该系统为基础的同源重组存在诸多缺点，例如：线性的 身代谢网络或引入外源代谢途径，从而构建高产工程 打靶ＤＮＡ易被 ＲｅｃＢＣＤ核酸酶降解，打靶片段所需同 菌生产高附加值产物，已成为国内外研究的热点。传 源臂较长，操作复杂且同源重组效率低，重组子难以获 统的Ｒｅｄ同源重组用于基因修饰后会在基因组中留下 得等。 一段“疤痕”，影响后续的基因操作和微生物的遗传稳