白介素-24抑制胶质瘤细胞生长的体内外试验研究.DOCVIP

白介素-24抑制胶质瘤细胞生长的体内外实验研究摘　要:目的　探讨白介素-24基因转染对胶质瘤生长的影响。方法　将载有人白介素-24 cDNA的新型重组腺病毒(Ad5F35-IL24)感染人胶质瘤细胞系U251,体外观察Ad5F35-IL24对该细胞系生长的影响;建立人胶质瘤动物模型,瘤内注射Ad5F35-IL24,观察肿瘤生长情况;用流式细胞仪检测其凋亡和Bax/Bcl-2的表达情况。结果　Ad5F35-IL24感染U251细胞和肿瘤组织后, IL-24蛋白高表达,U251细胞和组织的生长受到明显抑制,其凋亡率明显升高, Bax/Bcl-2也明显升高。结论　白介素-24具有抑制人胶质瘤细胞系U251生长和诱导凋亡作用。Ad5F35-IL24转导白介素-24基因可能是一种有效的胶质瘤基因治疗途径。 恶性胶质瘤是一种最常见的中枢神经系统恶性肿瘤,常规治疗的效果均不理想,目前还没有有效的治疗方法。近年来,随着分子生物学、分子遗传学的发展,基因治疗的研究发展较快,为恶性胶质瘤的治疗开辟了新的道路。白介素-24( interleukin-24, IL-24)是白介素-10细胞因子家族中的新成员,最初发现IL-24基因在终末分化的人类黑色素瘤中高度表达,因此也被称为黑色素瘤分化相关因子-7(melanoma differentiation-associated gene-7,mda-7)基因[1]。有研究表明, IL-24对人多种肿瘤细胞(如肺癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌等)均有选择性抑制作用[2-9],因此, IL-24成为基因治疗的候选基因。 　　本研究应用载有IL-24基因的新型重组腺病毒(Ad5F35-IL24)感染人胶质瘤细胞系U251,观察IL-24基因对胶质瘤细胞在裸鼠体外和体内的影响,探讨IL-24基因对胶质瘤细胞的治疗作用及其可能的作用机制。 1　材料与方法 1. 1　材料 　　载有IL-24基因的重组腺病毒(Ad5F35-IL24)及对照病毒Ad5F35-EGFP由北京市本元正阳基因技术有限公司提供,Ad5F35-IL24病毒滴度为2. 8×109PFU/m,l Ad5F35-EGFP病毒滴度为5. 8×109PFU/m;l人胶质瘤细胞株U251购自中国科学院上海细胞生物学研究所,细胞在DMEM培养基传代培养。鼠抗人GFAP抗体、S-P免疫组化试剂盒及显色剂购自美国ZYMED公司,噻唑蓝(MTT)、DMEM和F12-DMEM培养基购自Sigma公司,Bax、Bcl-2和IL-24抗体购自美国Santa Cruz公司。 　　实验动物:BALB/c裸鼠,共18只,雄性, 4周龄,体质量14~18 g,购于北京大学实验动物学部,许可证编号: SIXK(京)2006-2008。裸鼠饲养于白求恩国际和平医院动物饲养室,动物实验时严格执行无菌操作。 1. 2　方法 1. 2. 1　星形胶质细胞的原代培养、纯化、鉴定　　人星形胶质细胞原代培养的胎脑取自河北省人民医院妇产科引产的胎儿(胎龄5个月),引产后征得产妇同意(已签知情同意书),于胚胎死亡1 h内取材。无菌条件下于胚胎前囟对应的大脑皮质内取材,经漂洗、消化、过滤、离心等一系列步骤后,于孵箱中进行培养。24 h后换液继续培养。培养8 d后,以0. 25%胰酶消化并重新贴壁, 2 h后弃去悬浮细胞;之后每隔3~4 d重复上述消化步骤1次,约14 d[10]。 　　以星形胶质细胞特异性标志胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)表达与否作为鉴定指标之一。免疫组化采用S-P法,按说明书进行操作,以PBS代替一抗作为阴性对照,以细胞质内出现明确棕黄色反应判定为阳性结果。1. 2. 2　IL-24转染U251及人脑星形胶质细胞　　用PBS和Ad5F35-EGFP作空白和阴性对照,转染时间都在细胞传代后6 h,细胞贴壁生长后加入病毒感染液,继续孵育2 h后弃去病毒感染液,接着加入新鲜培养基继续培养。在培养的第2、3、4天用Western blot检测IL-24蛋白在细胞中的表达。 1. 2. 3　MTT法检测病毒滴度与细胞存活的关系　　将常规培养48 h呈指数生长期的U251胶质瘤细胞制成单细胞悬液,计数并调整细胞数为1×105ml-1,以100μl/孔接种于96孔板,培养6 h,当细胞贴壁生长后,吸去培养液,分别加入PBS、含Ad5F35-IL24分别为105、5×105、106、2×106、5×106、107PFU/ml的PBS各100μ,l继续孵育2 h后弃去病毒感染液,加入新鲜培养基,继续培养72 h后加入MTT(5 mg/ml)20μ,l接着再培养4 h,随后在560 nm波长下测定各孔的吸光度值[D(560)],最后以