普洛麦格双报告检测.pdf

双荧光素酶报告基因检测: 一种结合萤火虫和海肾荧光素酶 检测的先进辅助报告基因技术 （原文在Promega notes 57 第2 页） 摘要 在用萤火虫荧光素酶定量基因表达时,通常采用第二个报告基因来减少实验误差。但是，传 统的辅助报告基因 (例如，CAT, β-Gal 或GUS)却不够便利,因为各自的检测化学,操作要求,测量 特点有很多不同之处。普洛麦格公司提供一种先进的双报告基因技术,是萤火虫荧光素酶检测和 海肾荧光素酶检测的组合。使用双荧光素酶报告基因检测系统,再结合一套 pRL （或phRL 、 phRG ）载体系统，即表达第二个报告基因海肾荧光素酶的载体系统,就可以在单管中进行双荧 光素酶报告基因的检测,极为快速、灵敏、简便。系统还提供被动裂解液（PLB ）,用来裂解在 多孔板中培养的哺乳动物细胞并定量溶解两种荧光素酶,不必要对每一个样品分别进行单独操 作。对于正在使用萤火虫荧光素酶报告基因载体的研究人员，双荧光素酶报告基因检测系统将 使他们立即体会到该系统的便利。 介绍 两个报告基因用在一个实验系统中，是为了进行相互测量，或称为比率测量。 通常一个 报告基因作为内对照, 使另一个报告基因的测量结果正态化。在测量基因表达时，双报告基因 通常用于培养细胞的瞬时转染，即：一个含有实验用报告基因的载体与第二个作内对照的，含 不同报告基因的载体共同转染培养细胞。一般是将实验用报告基因与调控启动子偶联在一起, 研究被调控基因表达的结构或生理基础。报告基因表达活性的相对改变与偶联的调控启动子的 转录活性的改变相关。为了提供一个转录活性的内对照, 第二个报告基因与一个组成型启动子 偶联，这个启动子不受各种实验条件变化的干扰。通过这种方法, 有可能把可能削弱实验准确 性的内在因素的变化降到最小, 这些内在因素包括：培养细胞的数目和健康状况的差别, 细胞 转染和裂解效率的差别等。 使用萤火虫荧光素酶, 结合氯霉素乙酰转移酶(CAT), β-半乳糖苷酶( β-Gal), 或葡萄醛酸 糖苷酶(GUS) 的双报告基因, 近几年已普遍使用。然而，这些辅助报告基因组合却削弱了荧光 素酶的性能优势。比如荧光素酶的检测和定量可在几秒钟内进行, 但CAT, β-Gal 和GUS 的检 测是末端检测，在定量前需要长时间的温育。另外,这些除荧光素酶以外的报告基因仅有有限的 灵敏度和线性应答范围, 实验时必须小心，不要超过这些范围。 细胞内源活性也会干扰这类 报告基因的使用。许多类型的细胞有内源β-Gal 或GUS 表达, 不利于准确定量报告基因表达。 还有，内源去乙酰酶活性也干扰CAT 的活性检测。尽管在高温下预处理细胞裂解液(1,2), 可以 降低内源性β-Gal 和CAT 对检测的干扰，但这些处理也会快速失活荧光素酶。因此,在此类双 报告基因测量实验中, 必须分开，并以不同的步骤分别处理共转染的细胞裂解液。 理想的双报告基因方法应该使使用者能够以检测萤火虫荧光素酶的速度,灵敏度和线性范 围，对同一样品中的两个报告基因进行检测。这在传统的报告基因, 如CAT, β-Gal 和GUS， 因其检测化学,操作要求所固有的局限，是不可能做到的。相反,通过组合萤火虫(Photinus pyralis) 和海肾(Renilla reniformis)两种荧光素酶，普洛麦格公司的双荧光素酶报告基因检测(DLR)系统 Promega 公司荧光素酶技术系列产品指南 以一体化的单管配方，满足了这些要求。 双荧光素酶报告基因检测化学 虽然荧火虫和海肾荧光素酶都具有生物发光报告基因的卓越的检测特点, 但它们却具有完 全不同的进化起源, 因而它们的酶结构和底物要求完全不同。我们利用这些差别发展了 DLR 检测化学, 选择性地区别这两种发光报告基因的活性。萤火虫荧光素酶是一个61kDa 单亚基蛋 白质, 酶活性不需翻译后修饰(3,4) 。因此，一旦翻译完成即具有遗传报告基因的功能。在ATP, 2