环介导等温扩增法快速检测霍乱肠毒素A亚单位基因.PDFVIP

·¨7· ．短篇论著． 环介导等温扩增法快速检测霍乱肠毒素A亚单位基因 王虹玲朱水荣张政 霍乱是由霍乱弧菌引起的、以腹泻为主要症状的烈性传 1—3个单个菌落于装有100山DEPC处理水的微量离心管 染病。以发病急、传播快、涉及范围广、能引起大流行为特 min后， (Eppendorf管)中，放于金属裂解仪中100℃10 征，属甲类传染病，曾引起多次世界大流行…。霍乱弧菌广 min，取上清，4℃保存备用。 8000×g离心5 泛地存在于水体和海产品中，浙江地处沿海，人们大多喜食 4．霍乱弧菌的稀释与计数：取菌量为5×107CFU／ml的 海产品，因此霍乱仍是沿海地区最主要的传染病。霍乱肠毒 标准株M045，用双蒸水进行lO倍稀释，从lO～一lO“稀释 紊A亚单位基因(ctxA)是霍乱弧菌毒力的决定因素。目前液中吸取100m到普琼培养基平皿上，用L棒及时涂布均 检测ctxA主要采用普通PCR和实时荧光PCR方法，该2种匀，每个稀释度做5个平皿，于普通培养箱37℃培养24h后 方法虽敏感、特异，但需要特殊仪器，不适宜于基层实验室开 进行计数。 展应用，因此极大地制约了基层实验室对于霍乱疫情的快速 5．引物设计与合成：针对霍乱弧菌洲基因设计4条 诊断。2000年Notomi等开发出一种新的DNA环介导恒温 isothermal 扩增法(100p—mediatedamplification，LAMP)，因其 具有操作简便易行、结果判读简单等特点，尤其是可以在基 层实验室广泛使用，现该方法已经被广泛应用于多种病原微 生物的快速检测悼J。目前，国内应用．LAMP技术检测ct．cA 未见文献报道，笔者针对霍乱弧菌主要毒力基因ctxA设计 司合成。 LAMP引物，采用参考文献[3．4]中的方法与体系对85株不 同实验对照株和模拟样本进行检测，其结果与荧光定量PCR 结果比较，以验证方法的特异度和灵敏度，现将实验结果报 告如下。 外引物的浓度比例为8：1)、Betaine、模板等，反应条件60℃ 一、材料与方法 1h，80℃2win。 1．菌株来源：霍乱弧菌标准株M045、小川型、稻叶型等 7．LAMP方法验证：(1)检测限试验：取不同稀释度活菌 13株种系背景明确的霍乱弧菌不同实验对照株来自中国疾 菌液100山提取DNA(水煮法)用以进行方法敏感度的检 病预防控制中心，30株0139群霍乱弧菌地方分离株、10株 测，LAMP试验时，25一反应体系中加入模板4一。(2)特 01群霍乱弧菌地方分离株及32株其他肠道菌均由浙江省异度试验：对13株种系背景明确的霍乱弧菌不同实验对照 疾病预防控制中心菌种室提供。 株、30株0139群霍乱弧菌地方株、10株Ol群霍乱弧菌地 2．主要试剂与仪器：普通营养琼脂和4号琼脂购自杭 方株及32株其他非0139群霍乱弧菌肠道菌共85株提取 州天和微生物试剂有限公司；dNTP、焦碳酸二乙酯(DEPC) DNA，用LAMP反应系统进行检测，结果与实时荧光定量 处理水购自Tal(aR丑宝生物(大连)工程有限公司；Bst酶购 PCR结果进行比较，以验证方法的特异度。 自纽英伦生物技术有限公司；Betaine、Mgs04、MnCh、Calcium 8．LAMP阳性结果判定：肉眼观察产物颜色变化，出现 购自Sigma公司。MiniRu