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降解β—胡萝卜素葡萄球菌化学合成策略分析 　　沙棘又名黑刺、酸刺，因果实中含有丰富的维生素、类胡萝卜素、矿物元素、氨基酸和生物活性物质被称为“天然维生素之王” [1-3]。沙棘广泛分布在中国西北、西南，以沙棘果为原料酿造而成的沙棘果酒，具有增强毛细血管新陈代谢和延缓人体衰老的功能，长期饮用能健胃补脾、抑制心血管疾病的发生，起到抗癌和抗衰老的作用[4-5]。沙棘酒最大的缺陷是香味寡淡，酒香不协调，而沙棘含有丰富的beta;-胡萝卜素，beta;-胡萝卜素在微生物酶的作用下，可以降解产生小分子的酮如氧化异佛尔酮、beta;-大马酮、beta;-紫罗兰酮、假紫罗兰酮和二氢猕猴桃内酯等[6-9]，这些化合物都是构成沙棘酒香味的重要物质[10-11]。 　本研究在酿酒过程中分离出一株可以降解beta;-胡萝卜素的细菌，经初步鉴定是葡萄球菌，用天然培养基培养该菌，生长良好。但是由于天然培养基含有酵母浸粉，其高粘性不利于后续酶的分离纯化，并且酵母浸粉的组成成分不明确，影响进一步了解微生物的生命活动及其代谢过程[12-15]。所以，有必要优化出一种合成培养基，它既不影响菌的生长，又便于对降解过程产生的酶的研究。本研究的目的在于筛选一种适合于该菌生长和产酶的化学合成培养基，从而为类胡萝卜素降解酶的代谢调控机理提供理论依据。 论文代写 　1 材料和方法 　1.1 材料与设备 　1.1.1 菌种 葡萄球菌（Staphylococcus sp.）TS-82，本实验室分离筛选。 　1.1.2 仪器与设备 UV-3802型比例双光束紫外-可见分光光度计，尤尼柯（上海）仪器有限公司；SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵，郑州长城科工贸有限公司；恒温振荡器，上海福玛实验设备有限公司；HC-3018R高速冷冻离心机，安徽中科中佳科学仪器有限公司，Sartorius 标准型PB-10 pH计、电子天平，上海精密科学仪器有限公司； DH-420型电热恒温培养箱，北京科伟永兴仪器有限公司；立式压力蒸汽灭菌锅，上海博讯实业有限公司。 　1.2 培养基 　天然培养基为改良察氏培养基，合成培养基是在本实验室麻俊侠[13]的研究基础上优化得到的，不同培养基的成分及配方如表1所示。 　1.3 菌种培养及测定 　分别取制备好的培养基50 mL置于100 mL的灭菌三角瓶中，将保藏菌种接种于天然培养基A，在37 ℃、130 r·min-1的摇床上振荡培养至对数生长末期，之后将此菌液按5%的体积比接种于合成培养基B，采用UV-3802型比例双光束紫外-可见分光光度计测定其在培养基生长的最大生物量，以未接种的培养基作为空白。培养完成后，培养液在4 ℃、8 000 r·min-1离心20 min，得到粗酶液，用于测定降解能力。 毕业论文 　1.4 beta;-胡萝卜素储备液的制备 　在避光条件下，将5 mg beta;-胡萝卜素溶于10 mL的二氯甲烷中，待beta;-胡萝卜素彻底溶解后加入1 g吐温-80，使二氯甲烷完全挥发，再加入50 mL无菌蒸馏水混匀，得橘黄色、清澈的储备液，置于4 ℃冰箱中待用。 　1.5 beta;-胡萝卜素标准曲线的绘制及含量测定 　分别取beta;-胡萝卜素储备液0，20，40，60，80，100， 　120，140 mu;L，加蒸馏水至3.25 mL，以蒸馏水做空白，于460 nm波长处测其吸光度，用所得数据作图可得beta;-胡萝卜素溶液浓度与吸光度的线性关系，浓度与吸光度的线性关系式： 　y =14.97x-0.173 （R2=0.990） 　式中，x为beta;-胡萝卜素水溶液的吸光度，y为beta;-胡萝卜素在水溶液中的浓度（mu;mol·L-1）。 　1.6 化学合成培养基单一成分缺失试验设计 　在化学合成培养基B中每次去掉其中一种物质得到单一成分缺失培养基，并培养菌种。若缺失培养基上菌种生长良好，则该物质并不是必须营养，反之则为必须营养素。利用分光光度法，以未加入beta;-胡萝卜素储备液的粗酶液作为空白对照。在光程为1 cm的玻璃比色皿中加入3 mL的粗酶液（提前在37 ℃的水浴中保温），并加入0.2 mLbeta;-胡萝卜素储备液，在规定时间内测定460 nm的吸光值，前20 min每隔4 min测定一次吸光值，随后每隔5 min测定一次吸光值，测定55 min内beta;-胡萝卜素的降解量。在单一成分缺失（氨基酸，无机盐）培养基中，研究beta;-胡萝卜素的降解效果，判断该缺失成分为必需营养素、半必需营养素还是非必需营养素。以上所有试验重复3次，每次3个平行，结果以平均值表示。 　2 结果与分析 　2.1 天然培养基和合成培养基上的菌种培养 　由图1可以看出，合成培养基与天然培养液菌体生长状