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膜片钳原理 离子通道研究方法 结构研究：分子生物学方法确定蛋白质序列；X光绕射方法确定其三维立体结构。 功能研究：电生理测定通过离子通道的电流或测量细胞膜电流或膜电位的变化，反映离子通道个体或群体的分子活动。 结构和功能相结合：利用基因突变技术在一级结构的特定部位删除、添加或改变残基的序列，然后检测突变后的功能改变。 离子通道功能观察 电压钳技术 实验数据 电压钳原理 电压钳的特点 膜片钳技术 发展历程 膜片钳原理 电压钳模式（VC） 电流钳模式（CC） 测试模式（TEST） 搜索模式（SEARCH） 两种技术对比 记录模式 细胞吸附模式 全细胞记录模式 具体步骤 细胞封接过程 测量膜阻抗 电流钳记录数据 不同类型信号 电压钳记录数据 Isolation from mechanistic vibration (isolation table) Isolation from thermal electrical noise Smooth and stable manipulator Good teacher 注意事项 Intra-/Extra-cellular ：They are different! Cells can tolerate some difference between intra- and extra-cellular solution, however only slowly and not more than 30 mmol/L pH ：(Sometimes could be changed, especially when you use high concentration of drugs in solution.) Concentration of detergent ：(Wash all the glass containers by yourself. In addition watch the DMSO concentration) Contamination ：(For long-term recording such as slice experiments) Preservation ：(Use good airproof containers) 注意事项 切记不可短路； 将不按照玻璃电极的金属电极直接入水； * 2013-4-10 Focus on Patch clamp 2013 刘亚丰 仪器介绍 操作步骤 注意事项 报告提纲 对离子通道功能的研究，主要采用记录离子通道电流来间接反映离子通道功能，目前有如下两种技术 电压钳(Voltage clamp)技术 膜片钳(patch clamp)技术 20世纪初由Cole发明，后由 Hodgkin和Huxley完善，最初是为证明动作电位产生机制，他们的实验首次证明参与动作电位的离子流由Na, k ,Cl三种成分组成，并对这些离子流进行了定量分析； 当时没有直接测定膜通透性的方法，于是就用膜对某种离子的电导来代表该种离子的通透性，膜电导测定的依据是电学中的欧姆定律，通过测量膜电流，再利用欧姆定律来计算膜电导。 利用膜电流来计算膜电导时，记录膜电流期间的膜电位必须保持不变，否则膜电流的变化就不能代表膜电导的变化。这一条件是利用电压钳技术实现的。 这一技术对阐明动作电位的本质和离子通道的的研究做出了极大的贡献。 cole K+电流 Na+电流 用两根尖端直径0.5um的电极插入细胞内：一根电极用作记录电极以记录跨膜电位，另一根电极作为电流注入电极，以固定膜电位，实现固定膜电位的同时记录膜电流。 电位记录电极引导的膜电位（Vm）输入电压钳放大器的负输入端，而人为控制的指令电位（Vc）输入正输入端，放大器的正负输入端子等电位，向正输入端子施加指令电位（Vc）时，经过短路负端子可使膜片等电位，即Vm=Vc,从而达到电位钳制的目的，并可维持一定的时间。 Vc的不同变化将导致Vm变化，从而引起细胞膜上电压依赖性离子通道的开放，通道开放引起的离子流反过来又引起Vm的变化，致使Vm≠Vc, Vc与Vm的任何差值都会导致放大器有电压输出，将相反极性的电流注入细胞，以使Vc=Vm，注入电流的大小与跨膜离子流相等，但方向相反。因而注入的电流被认为是标本兴奋时的跨膜电流值（通道电流）。 指令电位（Vc) + _ Vo 电位记录电极（Vm) 电流注入电极(I) 电压钳技术主要用于巨大细胞的全细胞电流研究，特别在分子克隆的卵母细胞表达电流的鉴定中发挥其它技术不能替代的作用。但也有一些弱点： 1、微电极需刺破细胞膜进入细胞，以致造成细胞浆流失，破坏了细胞生理功能的完整性； 2、不能测定单一通道电流。因为电压钳制的膜面积很大，包含着大量随机开放和关闭着