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放线菌的分离与提纯 摘要： 放线菌是一类呈菌丝状生长，主要以孢子或菌丝状态存在于土壤、空气和水中，革兰染色为阳性的单细胞原核微生物，是细菌中的一种特殊类型。放线菌与人类的生产和生活关系极为密切，在医药工业上有重要意义。本实验我们主要采用无菌培养、稀释法等方法对放线菌进行培养、分离和纯化，经过倒平板、制备梯度稀释液、涂布、培养、挑单菌落、保存等步骤即可使放线菌在固体培养基上形成单独菌落，并可得到纯菌株。 关键词： 放线菌 分离 无菌 一、实验目的 学习从土壤中分离放线菌。 二、实验原理 放线菌是重要的抗生素产生菌，主要分布在土壤中（主要是链霉菌），其数量仅次于细菌。一般在中性偏碱性、有机质丰富、通气性好的土壤中含量较多。由于土壤中的微生物是各种不同种类微生物的混合体，为了研究某种微生物，就必须把它们从这些混杂的微生物群体中分离出来，从而获得某一菌株的纯培养。根据放线菌的营养、酸碱度等条件要求，常选用合成培养基或有机氮培养基。如果培养基成分改变，或土壤预先处理（120℃热处理1h），或加入某种抑制剂（如加数滴10%酚等），都可以使细菌，霉菌出现的数量大大减少，从而淘汰了其它杂菌。再通过稀释法，使放线菌在固体培养基上形成单独菌落，并可得到纯菌株。 三、仪器与材料 （一）培养基 高氏I号培养基 可溶性淀粉 2g KNO3 0.1g K2HPO4 0.05g MgSO4·7H2O 0.05g NaCl 0.05g FeSO4·7H2O 0.001g 琼脂 2g 自来水 100mL pH 7.2～7.4 灭菌 1.05kg/cm2，20min （二）．溶液或试剂 10%酚液，盛9ml无菌水的试管，盛90ml无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶，4%水琼脂。 （三）.仪器 无菌玻璃涂棒、无菌吸管、接种环、无菌培养皿、链霉素和土样、显微镜、电热恒温水浴锅涂布器等。 （四）.流程 倒平板→制备梯度稀释液→涂布→培养→挑单菌落→保存 四、操作步骤 （一）．来源 土壤中放线菌丰富，品种齐全，可以筛选出新的放线菌。 （二）．培养基的制备 1、称量和溶化 按配方先称取可溶性淀粉，放入小烧杯中，并用少量冷水将淀粉调成糊状，再加入少于所需水量的沸水中，继续加热，使可溶性淀粉完全溶化。然后再称取其他各成分，并依次溶化，对微量成分FeSO4 ．7 H2 O可先配成高浓度的贮备 液，按比例换算后再加入。待所有试剂完全溶解后，补充水分到所需的总体积。 配制固体培养基时，将称好的琼脂放入已溶的试剂中，在加热融化，最后补充所损失的水分。 2、调pH 用试纸测培养基的原始PH,如果偏酸，用滴管向培养基中加入1mol/LNaOH,边滴边搅拌，并随时用pH试纸测其pH,直至pH达7.6。反之，用1mol/LHCI进行调节。 3、分装和加塞 将配制的培养基分装入试管内，在试管口或锥形瓶口上塞上棉塞。 4、包扎 加塞后，将全部试管用麻绳捆好，再在棉塞外包一层牛皮纸，其外再用一根麻绳扎好。用记号笔注明培养基名称、组别、配制日期。 5、灭菌 将上述培养基以1210C,20min,0.103MPa高压蒸汽灭菌。 6、搁置斜面 将灭菌的试管培养基冷却至500C左右，将试管口端搁在玻璃棒上。斜面的斜度要适当，使斜面的长度约为管长 1/3。 7、无菌检查 将灭菌培养基放入370C的培养箱中培养24～28h，以检查灭菌是否彻底。 和改良的差别就在于有没有FeSO4· 7H2O 高氏常常配完后变成褐色也是由于Fe2+氧化为Fe3+的关系，所以常常有人用FeSO4，防止氧化。 （三）．取样及预处理 取5cm以下的土样，放于灭菌过的牛皮纸袋中，室温保存10天左右。 (四)．分离 1、倒平板 将高氏I号培养基加热熔化待冷却至55-60°c时倒入培养皿。倒平板的方法：右手持盛培养基的试管或三角瓶置于火焰旁边。用左手将试管塞或瓶塞拔出，试管口或瓶口保持对着火焰；然后左手拿培养皿并将皿盖在火焰近打开一缝，迅速倒入培养基15ml-20ml，加盖后平置于桌面上，待凝后即为平板。 2、制备土壤稀释液 称取土样10g，去花坛等地方的土样，选好采样地点，除去表层5cm。用无菌器具规范采样几十克，装入无菌塑料袋扎好。采样后应尽快分离。振摇约20min，使土壤与水充分混匀，将细胞分散。放入盛有90ml无菌水的三角瓶中，充分混合。用一支1ml无菌吸管从三角瓶中吸取1ml土壤悬液盛入放有9ml无菌水的试管中充分混匀，然后从此试管中吸取1ml加入另一盛有9ml无菌水的试管中，混合均匀，以此类推，制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6共六种不同稀释度的土壤溶液。 3、涂布 将上述每种的三个平板底面分别用记号笔写上10-4、10-5、10-6三种稀释度，然后用无菌吸管分别由10-4、1