生命科学与技术学院(2012年)_生科院毕业论文写作编辑模板.docVIP

木聚糖降解菌的筛选及分子鉴定 作 者：××× 指导老师：××× 摘要：从宝天曼地区采集的腐木中富集、分离出了16株能够降解木聚糖的菌株。利用刚果红活性染色法对菌株进行染色，根据透明圈的大小筛选出6株产木聚糖酶菌株。6株菌株在摇床180 r/min、28 ℃的条件下发酵培养48 h，利用DNS法测定各菌株木聚糖酶的活力大小，结果表明菌株M3的酶活力最高，酶活力为19.098 U/mL。提取菌株M3的基因组进行26S rDNA PCR扩增并进行序列测定，经相似性分析和系统发育树分析，初步鉴定菌株M3属于Trichosporon porosum。 关键词：15%~30%，其中主要成分是木聚糖。与纤维素相比，半纤维素更易为微生物所降解和转化[1]。木聚糖酶是一类以内切方式降解木聚糖分子中β-1,4-木糖苷键的酶类，其水解产物主要是木二糖和木寡糖，也有少量木糖和阿拉伯糖。该酶具有广泛的应用前景[2]，该酶在造纸业中部分替代二氧氯用于纸浆漂白，可改善纸浆性能；木聚糖酶作为饲料添加剂，可提高饲料的能量值和禽、畜对饲料的利用率；食品工业中可利用木聚糖酶降解半纤维素的主要成分木聚糖生产低聚木糖等高附加值的产品。可见木聚糖酶在工业中的用途非常广泛。因此国内外很多研究者都致力于对木聚糖酶的研究，已有不少研究者对黑曲霉、木霉(Trichoderma sp.)等真菌及短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、环状芽孢杆菌(B.circulans)等细菌的木聚糖酶进行了研究。 森林腐木中富含半纤维素，这种环境中有大量的微生物都能分解木聚糖，从中很容易筛选得到高效降解木聚糖的菌株。本研究主要从宝天曼森林腐木中富集、分离、筛选出产木聚糖酶菌株，并分析它们木聚糖酶的酶活力大小，找出酶活力较高的分离菌株。最后通过分子生物学方法测定分离菌株的26S rDNA序列并对其进行序列相似性分析和系统发育树分析，初步鉴定出分离菌株在系统发育上的分类地位。 1 材料与方法 1.1 样品 取自实验室保存的宝天曼地区采集的腐木。 1.2 试剂 2.2%溴钾酚绿、1%刚果红溶液、1 mol/L NaCl溶液、柠檬酸缓冲液、木糖溶液、DNS试剂、试剂酵母基因组提取试剂盒、PCR Magic Mix2.0、引物NL1、引物NL4、TAE缓冲液、琼脂糖凝胶、EB试剂。 1.3 培养基[3] 富集培养基：木聚糖1%、酵母氮基础培养基1%、氯霉素(80 μL/100 mL)； 分离培养基：酵母提取物0.5%、葡萄糖1%、溴钾酚绿2%、琼脂2%、氯霉素（80 μL/100 mL1%、酵母氮基础培养基1%、琼脂2%、氯霉素（80 μL/100 mL斜面培养基：酵母粉0.3%、麦芽粉0.3%、蛋白胨0.5%、琼脂2%、氯霉素（80 μL/100 mL1.4 菌株筛选[4,5] 1.4.1 富集培养 取7支干净小试管，向每支试管中分装入3～5 mL121 ℃高压灭菌锅中灭菌20 min。用镊子夹取少许实验室保存的7种森林腐木分别放入已灭菌的富集培养基中，于28 ℃温箱中富集培养2～3 d1.4.2 平板分离 对培养后变混浊的富集培养液按照梯度稀释法用无菌水稀释到10-5，在超净工作台中的无菌条件下，准确吸取100 μL的10-3～10-5不同稀释倍数的菌液涂布于已灭菌的平板培养基上，于28 ℃温箱中倒置培养2～3 d。 1.4.3 纯化菌种 根据菌落形态特征的比对，找出不同形态的菌株。在无菌条件下，挑取不同形态的单菌落在已灭菌的纯化培养基上进行扇形划线，于28 ℃温箱中倒置培养2～3 d。按照同样的方法划线2～3次后即可得到纯菌落。 用镊子夹取已灭菌的牙签，将纯化培养基中的纯菌落点蘸到鉴别培养基上，于28 ℃温箱中倒置培养2～3 d。待菌落长大后用1%刚果红进行活性染色30 min，倾去染液，再用1 mol/L NaCl溶液漂洗1 h，观察菌落周围是否有透明圈出现以及透明圈的大小。出现透明圈的菌落即为所需要的木聚糖降解菌，再选出透明圈大且明显的菌株接种到斜面培养基上于4 ℃冰箱中保存备用。 1.5 木聚糖酶活力的测定 1.5.1 木糖标准曲线的制备 取烘干好的木糖0.1000 g溶解于蒸馏水中后，再用100 mL容量瓶定容至100 mL，得到1 mg/mL的木糖溶液。用木糖制备标准曲线的体系见表1。 表1 制备木糖标准曲线的溶液体系 （单位：mL） 编号 0 1 2 3 4 5 6 木糖标准液 蒸馏水 DNS 0 2.0 1.5 0.2 1.8 1.5 0.4 1.6 1.5 0.6 1.4 1.5 0.8 1.2 1.5 1.0 1.0 1.5 1.2 0.8 1.5 注：表中所用试剂为纯试剂 取7支带刻度的平底试管，编号为1～75 min后，立即放入冷水中