水中大肠杆菌群检测方法－滤膜法.DOCVIP

水中大腸桿菌群檢測方法－濾膜法 NIEA E202.54B 一、方法概要 　?? 　本方法係用濾膜檢測水中好氧或兼性厭氧、革蘭氏染色陰性、不產芽孢之大腸桿菌群（Coliform group）細菌。該群細菌在含有乳糖的LES Endo agar或m-Endo broth培養基上，於35 ± 1℃培養24 ± 2小時會產生具金屬光澤菌落。所有缺乏金屬光澤的菌落，均判定為非大腸桿菌群。 二、適用範圍 　? 　本方法適用於地面水體、地下水體、廢水、污水及海域水質之大腸桿菌群檢測。 三、干擾 (一) 水樣中含有抑制或促進大腸桿菌群細菌生長之物質。 (二) 檢測使用的玻璃器皿及設備含有抑制或促進大腸桿菌群細菌生長的物質。 (三) 濁度過高之水樣易造成濾膜孔隙阻塞，或造成細菌菌落瀰漫生長（spreading）而影響水樣檢驗的觀察及結果的判讀。 四、設備及材料 (一) 量筒：100至1000 mL之量筒。 (二) 吸管：有0.1 mL刻度之10 mL之無菌玻璃吸管或無菌塑膠製吸管，或無菌微量吸管（micropipet）。 (三) 稀釋瓶：100至1000 mL可滅菌、具螺旋蓋之硼矽玻璃製品。 (四) 錐形瓶：200至1000 mL可滅菌之硼矽玻璃製品。 (五) 採樣容器：容量100 mL以上無菌之硼矽玻璃或塑膠製有蓋容器，使用市售無菌袋亦可。 (六) 培養皿：硼矽玻璃製或可拋棄式塑膠製培養皿，大小為60 × 15 mm、50 × 12 mm或其他適當大小。 (七) 過濾裝置：能耐高溫高壓滅菌的玻璃、塑膠、陶瓷或不鏽鋼等材質構成之無縫隙漏斗，以鎖定裝置、磁力或重力固定於底部。 (八) 抽氣幫浦：水壓式或吸氣式，壓力差最好在138至207 kPa者。 (九) 濾膜：使用材質為混合纖維素酯（mixed cellulose esters），直徑47 mm、孔徑0.45 μm且有格子記號的無菌濾膜。 (十) 鑷子：前端平滑、內側無波紋，使用前浸泡於95%酒精再以火燄燃燒滅菌。 (十一) 培養箱：溫度能保持35 ± 1℃者。 (十二) 加熱板：可調溫度，並附磁石攪拌功能。 (十三) 天平：待測物重量大於2 g時，須能精秤至0.01 g；待測物重量不大於2 g時，須能精秤至0.001 g。 (十四) 高壓滅菌釜：溫度能保持在121℃（壓力約15 lb/in2或1.1 kg/cm2）滅菌15分鐘以上。 (十五) 高溫乾熱烘箱：如用於玻璃器皿等用具之滅菌，溫度須能保持在160℃達2小時或170℃達1小時以上。 (十六) 水浴槽：溫度能保持在約50℃者。 (十七) 冰箱：溫度能保持在4 ( 2℃。 (十八) 無菌操作檯：正壓式無菌操作檯或垂直循環負壓式無菌操作檯（Class II生物安全櫃）。 (十九) pH計：pH計之精確度必須達到0.1 pH單位。用於內含瓊脂培養基之pH值測定時，應搭配表面電極（surface probe）。 五、試劑 (一) 試劑水：蒸餾水或去離子水，導電度在25 ℃時小於2 μmho / cm（μS / cm）。 (二) 培養基，應使用市售商品化培養基。 １、LES Endo agar培養基（又名m-Endo agar LES培養基） 　　每一公升之LES Endo agar培養基含下列成份： 　　 　 　　?? 將51 g m-Endo agar LES培養基粉末置於無菌錐形瓶，加入內含20 mL酒精（95%，v/v）之1公升試劑水，煮沸溶解後（註：此培養基不可高溫高壓滅菌），冷卻至45至50℃，於無菌操作檯內分裝至培養皿中，使培養基厚度約3至5 mm。置於室溫下凝固後，避光保存於4 ± 2 ℃，保存期限為14天。可根據檢測需求量，依配方比例配製培養基。 ２、m-Endo broth培養基 　　每一公升之m-Endo broth培養基含下列成分： 　　 　?????? 　　 　??????? 　　 　??????? 　　 　 　　 　 ?????????????? 　　 　 　　?? 將48 g m-Endo broth培養基粉末置於無菌錐形瓶，加入內含20 mL酒精（95%，v/v）之1 L試劑水，煮沸後（註：此培養基不可高溫高壓滅菌）冷卻，於無菌操作檯內分裝約1.8至2.2 mL培養液至含無菌吸收襯墊之培養皿中。未分裝之培養液應避光保存於4 ± 2 ℃，保存期限為96小時。可根據檢測需求量，依配方比例配製培養基。 (三) 無菌稀釋液 １、磷酸二氫鉀儲備溶液 　　?? 取3.4 g磷酸二氫鉀（KH2PO4）溶於50 mL的試劑水中，俟完全溶解後，以1.0 N NaOH溶液調整其pH值為7.2 ± 0.1，然後加試劑水至全量為100 mL，滅菌（過濾滅菌或121℃高溫高壓滅菌15分鐘）後，儲存於冰箱中備用