酵母双杂交技鉴定FAT10新的结合蛋白真核翻译延伸因子--1a1.pdfVIP

摘要 摘要 目的：本研究利用酵母双杂交技术筛选类泛素基因FATIO的相互作用蛋白， 中的作用机制提供依据。 肝癌细胞株Hep3B的酵母双杂交用cDNA文库；并构建“诱饵”质粒二、利用 clontech 与类泛素蛋白FATl0相互作用的蛋白分子，再通过回交试验进行初步验证；三、 利用免疫共沉淀和激光共聚焦细胞内共定位试验进一步验证FATl0和筛选蛋白 况。 结果：一、成功合成双链cDNA，均符合建库要求；库容量达到1．03x106克 106 109cfu／mL．插 隆，原始文库滴度为2．50xcfu／mL，扩增后的文库滴度为3．60x kb，完全满足后续的酵母双杂 入片段大小分和为0．5．3．5kb，平均长度约为2．0 交研究。并成功构建“诱饵”质粒pGBK7／FATl0．二、首先证实“诱饵”质粒 pGBK7／FATl0无自激活特性。通过酵母双杂交筛选出阳性克隆后测序证实有一 accessionNo．NM 基因eEFlAl(GenBank 和eEFlAl之f刚存在调控关系。 低。 关键词： 类泛素蛋白FATlO；eEFlAl；酵母双杂交系统；RNA干扰 Abstract ABSTRACT identified 1 1A objective：To factorA a eukaryoticelongation 1(eEF1)as FAT10 aeDNA fromahuman protein library binding byscreening hepatocellular carcinoma(HCC)cell a to line，Hep3B，usingyeasttwo-hybridsystem，then thefunctionofFAT10in investigate tumorigenesis． Methods：1．Toconstructa eDNA ofFATIO— yeasttwo-hybridlibrary Human Carcinoma3BCells．2．GAL4 overexpressHepatic yeasttwo—hybridassay was toscreentheHuman cellseDNA toobtain performed Hep3Bhepatoma library hostcell moleculeswhichinteractwithFATl0 protein byyeasttwo-hybrid．3．The immunofluoresenceCO--localizationand was to CO·-immunoprecipitationassayapplied confirmthe interactionsidentified．4．ThenFATl0wasknockdown