配子和胚胎的冷冻及复苏(规范朱桂金教授).ppt

胚胎的冷冻及复苏 华中科技大学同济医院生殖中心 朱桂金 2007，12，22 深圳 冷冻是保存组织和细胞重要方法（低温医学） 体外培养1年 干冰－79℃ 数月 液氮－196℃ 永久保存 分子运动，生理生化反应停止，任何损伤也无法修复 自发突变率1％ 一、冷冻对细胞的损伤(37 ℃ －196 ℃) 冷冻危险区（-15 ℃ — -50 ℃） 冰晶形成 溶液效应 渗性休克 保护剂毒性 寒冷 冰晶形成特点 有结构六角形晶体 只与水分子结合，排除其它溶质 先形成冰核，同质成核－35℃－40℃，异质成核－10℃－15℃（过冷） 一旦冰核形成，冰晶迅速增大 密度变小，体积增大 1. 冰晶形成及对细胞的损伤 体积增大产生压力，冰晶穿孔胞浆渗漏 细胞内物质分布改变 结晶只与水分子结合，排斥其它任何溶质，随着冰晶的增大，像犁一样将细胞的其它成分挤在狭小的空间，细胞内间隙缩小，细胞内成分相互接触，发生不正常反应 溶质浓度上升，结晶析出，PH变化，蛋白质可溶性降低，有害物质浓度升高 复苏后局部低渗，结晶的溶质不会再溶解 复苏气泡形成，冷冻速率快，气泡多而小，含碳酸盐严重 2. 细胞外溶液效应 细胞悬浮在溶液中 慢速冷冻细胞外液结冰导致细胞外渗透压上升是细胞脱水的关键 脱水太慢，溶液浓度过高对细胞内蛋白有毒性，（脂蛋白变性，细胞达到最小体积以下） 3. 渗性休克 复苏时细胞外冰融化造成低渗，细胞内渗透压高，细胞外水进入细胞内过快，细胞肿胀 4. 渗性保护剂的毒性 溶液浓度，暴露时间和温度越高毒性越大 不同种类渗性保护剂毒性的差别 5. 寒冷对细胞的损伤 37℃—0℃ 寒冷损伤, 20℃～ 0℃ 细胞膜双层脂质结构，含水30％～50％ ,其余为脂蛋白，对寒冷敏感，低温脂类变硬，脂蛋白分解，变性 脂质的含量和成分影响细胞对冷冻的耐受性 脂质含量丰富的牛、猪卵母细胞易受寒冷的损伤， 卵磷脂/胆固醇比值大，柔韧性好，耐受冷冻 二、预防冷冻损伤的方法 冷冻保护剂——渗性，非渗性，大分子 控制冷冻和复苏的速率－细胞种类，温度 快速去除冷冻保护剂 （一）冷冻保护剂的种类和作用 1. 渗性 2. 非渗性 3. 大分子 1. 渗性保护剂的作用 无限降低冰点 （1000g水＋1mol溶质 冰点降低1.86℃，浓度足够高冰点～共熔点玻璃化而不结冰） 与水形成氢键，维持结合水 替换细胞内液态水，细胞失水后体积和溶质浓度变化小 渗性保护剂的渗透性 2. 非渗性保护剂的作用 不能进入细胞内（蔗糖，葡萄糖，果糖，海藻糖） 冷冻时有助于细胞脱水 复苏时防止水分过快进入细胞，预防渗性休克，促进渗性保护剂外流 降低细胞膜损伤 3. 大分子物质 促进玻璃化形成 增加细胞膜的稳定性 减少渗性保护剂毒性， Ficoll，PVP，聚丙烯甘油，蛋白质 （二）影响冷冻速率的因素 细胞本身的特性：膜渗透性，表面积/体积比不同 温度 冷冻后膜渗透性改变 1. 细胞本身的特性 不同的细胞膜渗透性，表面积/体积不同，降温速率不同 鼠卵母细胞和胚胎耐受冷冻，猪牛差 人囊胚比早期胚胎渗性差，脱水慢 鼠胚0.5 ℃，卵母细胞0.3~1℃,精子10℃，仓鼠细胞100℃，红细胞1000℃/min） 2. 温度对脱水的影响 温度越高，脱水越快，温度每降10℃，脱水速度减半 降温速率过快 细胞膜的渗透性下降，细胞脱水越少，体积变化越少，水分未充分脱出，细胞内外大量冰晶形成 降温速率太慢 细胞脱水越多，最小体积的理论，永久的损害 细胞暴露在高渗环境时间长（溶液效应） 脂蛋白变性，细胞溶解 3.冷冻后细胞膜渗透性的改变 冷冻改变细胞的渗透性，原来不能通过细胞 膜的物质冷冻后可透过。 4. 解冻的速度 太快：胚胎吸收水分过快，过多－渗性休克 取出冷冻管在空气中停留40s 太慢：形成细胞内结晶 快慢之间界限很窄，细胞内重新结晶开始于－85 ℃ ～－70 ℃ ，冷冻管在空气中摇动一定时间当其温度接近－80，换成快速升温，置30 ℃水浴中 三、冷冻的方法（冻干技术） 程序，平衡，慢速 快速，玻璃化, 冰晶与玻璃态的区别 玻璃化 非结晶，无结构，玻璃样固态 瞬间终止一切活动，不存在离子和溶质在细胞内的再分布，理论上对细胞的损伤小 是保存生物样品材料理想的方法 四、冷冻的步骤 适应症 胚胎的选择 慢速冷冻 快速冷冻 胚胎冷冻的适应症 保存移植后剩余的胚胎 有OHSS危险患者的胚胎 接受赠卵 由于突发疾病或其它原因暂时不能移植 保存生育功能 胚胎的选择 符合移植或冷冻标准的胚胎囊胚形成率48～51％， 不符合者囊胚形成率41.7％ (Fert