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及厚朴酚对肝癌HepG2细胞生长抑制及凋亡作用 　 作者：顾伟, 范昕建*, 吴疆, 张莉敏, 李晓芳, 牛智强 【摘要】 　　目的: 研究和厚朴酚(honokiol)对人肝癌HepG2细胞增殖的影响及诱导凋亡作用。方法: 用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测不同浓度和厚朴酚对HepG2细胞的增殖活性的效应, 通过显微镜、 荧光染色观察细胞形态学变化; DNA片段化检测细胞凋亡; 流式细胞术检测和厚朴酚诱导细胞凋亡的凋亡指数(AI), caspase3、 8、 9活性的变化。结果: 和厚朴酚浓度为40～160 μmol/L时对HepG2细胞增殖有明显的抑制效应, 且呈剂量依赖性; 细胞加入和厚朴酚诱导24 h后AI明显高于未加入组(Plt;0.05), caspase3、 8、 9活性增高。结论: 和厚朴酚在一定浓度范围内能明显抑制HepG2细胞的增殖并能诱导其凋亡, 其作用呈浓度依赖性。它可能通过激活caspase途径诱导HepG2细胞凋亡。 【关键词】 和厚朴酚 HepG2细胞 增殖 生长抑制 凋亡 　　传统中药厚朴被广泛使用于治疗许多疾病, 和厚朴酚(honokiol)是木兰科植物厚朴(Magnolia officinalis)的有效成分, 是一种从中药厚朴中分离出来的具有生物活性的化合物, 据文献报道和厚朴酚具有抗氧化、 抗血栓形成、 抗菌、 和抗肿瘤［1-4］的作用。本研究观察了和厚朴酚对HepG2细胞增殖的影响及其诱导HepG2细胞凋亡的作用。 　　1 材料和方法 　　1.1 材料 流式细胞仪(EPICS ELITE ESP, Beckman Coulter), 二氧化碳(CO2)培养箱(SANYO), 倒置生物显微镜(Olympus), 凝胶成像系统(Gel Doc 1000, BIORAD), 24、 96孔培养板(Corning Incorporated), DMEM培养基(Gibco, Grand Island, NY, USA), 小牛血清购于兰州民海生物有限公司。Hoechest33258、 Annexin VFIFC细胞凋亡检测试剂盒购于凯基生物科技发展有限公司。琼脂糖, 溴化乙锭(EB), 甲基噻唑蓝(MTT), 二甲基亚砜(DMSO)购于Sigma (St. Louis, MO, USA)和厚朴酚(honokiol)标准品购于中国药品生物制品检定所, 用二甲基亚砜溶解(DMSO)(终浓度lt;0.01%)。人肝细胞癌细胞株HepG2, 来自ATCC,四川大学教育部移植免疫重点实验室细胞室保种。细胞接种在含100 mL/L小牛血清的DMEM培养液中, 在37℃、 50 mL/L CO2培养箱中培养。 　　1.2 方法 　　1.2.1 MTT 法检测 取对数生长期人肝细胞癌细胞株HepG2, 加入2.5 g/L胰蛋白酶消化, 吹打制成单个细胞悬液, 调整细胞密度为5×103/L, 以每孔体积200 μL接种于96孔培养板上。培养24 h, 待细胞贴壁后, 各孔分别加入不同浓度的和厚朴酚, 每孔体积均为200 μL, 使和厚朴酚终浓度分别为0(对照组)、 20、 40、 80、 160 μmol/L(用药组), 每个浓度作3个复孔, 同时点3块板。分别培养24、 48、 72 h后, 加入MTT20 μL/孔, 置于CO2培养箱中继续培养4 h后终止培养。小心吸弃孔内培养上清液, 每孔加入DMSO150 μL, 充分振荡, 使蓝紫色沉淀充分溶解。在30 min内用酶联免疫检测仪测定570 nm波长处的光吸收值A570 。不同时间点不同浓度和厚朴酚对肝癌细胞的增殖抑制率=(对照组A570－用药组A570)/对照组A570×100%。 　　1.2.2 形态学的观察 每瓶1×106个细胞的密度接种于50 mL 细胞培养瓶中, 培养24 h后加入浓度为0和40 μmol/L的和厚朴酚, 于24 h用倒置显微镜观察。 　　1.2.3 荧光染色 每瓶1×105个细胞的密度接种于24孔培养板中, 24 h后加入浓度为0和40 μmol/L的和厚朴酚, 培养24 h, 细胞在24孔培养板内原位固定染色。用磷酸盐缓冲液(PBS)洗1次, 用40 g/L多聚甲醛500 μL室温固定15 min, 用PBS洗2次, 弃废液, 加入终浓度为10 mg/L, Hoechst 33258溶液500 μL/孔, 37℃染色10 min, 荧光显微镜下观察。 　　1.2.4 DNA片段化电泳 收集1×106以上的细胞, 用PBS洗2次, 加入100 μL细胞裂解液(10 mmol/L TrisHCl pH7.4, 10 mmol/L EDTA pH8.0,