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电化学DNA传感器应用 　　1电化学DNA传感器的工作原理 　　电化学DNA传感器主要由表面固定了ssD-NA(单链DNA)[4]探针的电极金电极、玻璃电极和碳糊电极等)和检测用的电化学杂交指示剂(即标识物)两部分构成(如图1所示)。为了提高杂交的专一性,ssDNA片段长度范围一般从十几个碱基到几十个碱基,通常采用人工合成的短链寡聚脱氧核苷酸,其碱基序列与样品中的靶序列互补。在适当的温度、pH和离子强度条件下,固定在电极上的ssDNA与杂交缓冲溶液中的靶基因发生选择性杂交反应。如果样品中含有完全互补的DNA片段则在电极表面形成dsDNA(双链DNA),从而引起电极上电流值的变化,利用微分脉冲或循环伏安法可检测出dsDNA杂交信号。电化学杂交指示剂是一类能与ssDNA和dsDNA以不同方式相互作用的电活性化合物,其电活性可使检测时的测量电流增大,提高检测灵敏度,但电化学杂交指示剂的加入使电化学信号的本底加大,使检测的分辨率降低。提高电极上ssDNA探针的灵敏度,一方面与杂交指示剂对dsDNA和ssDNA的选择性结合能力的差异有关,另一方面与电极表面特异性吸附有关[5]。目前选用的嵌合剂均为单嵌合剂,可以考虑选用双嵌合剂和三嵌合剂。利用其“分子剪刀”的功能,改善其灵敏度和选择性。选用磷酸缓冲底液进行检测,可避免对指示剂的非特性吸附[6]。在基因检测方面采用计时电势信号转换模式(PSA)检测,比伏安法灵敏度高,并能获得有效的背景补偿,可在5~20min短时间内检测纳克(ng)的目标DNA序列[7]。采用光刻沉积技术制备的金膜作为传感电极[8],与巯基修饰的寡核苷酸探针自组装成的电化学核酸传感器,浓度检测线性范围为1.5~50nmol/L。以肽核酸[9](PNA)代替ssDNA作为探针分子修饰到电极表面,电极表面上的PNA仍能保持其在溶液中专一和有效的杂交特性,PNA识别层使传感器具有更高的灵敏度和专一性,杂交速度快,并且不受离子强度的影响。 　　2电化学DNA传感器的分类 　　DNA修饰电极是电化学DNA传感器的重要部分,该类传感器也多以此进行分类。ssDNA修饰(或固定)到电极上的方法,现有的文献报道主要集中在自组装膜法、吸附结合法、表面富集法、共价键结合法、化学免疫法、组合法、生物素-亲和素反应法和LB膜法等。本文主要叙述以下几种: 　　2.1吸附结合法 　　该方法是将碳糊电极放到含DNA探针分子的乙酸缓冲溶液中在一定电位下活化电极,然后在控制电位下吸附富集探针分子,最后用磷酸缓冲溶液淋洗后便可使用。其特点是简单、灵活,但稳定性不够。Pang[3,10]等研究证明,ssDNA在汞电极上的吸附性质为化学吸附,生成吸附化学键,质子化的ssDNA分子通过嘌呤和嘧啶碱基上芳香杂环的pi;键键合而吸附到汞电极上。Hashimoto[11,12]等采用吸附法在平面热解石墨电极上固定了DNA片段。他们[12]还通过化学吸附在金电极表面修饰了20mer的DNA探针,该探针与v-myc基因部分互补。Wang等[13]利用电化学富集方法将DNA修饰到碳糊电极(CPE)上,制成DNA探针修饰电极。 　　2.2自组装膜法 　　即基于分子的自组作用,在固体表面自然形成高度有序的单分子层膜的方法。在DNA技术中,一般是利用带巯基(“SH)的化合物在金电极表面上可以形成自组装单分子膜的特性来固定核酸。其特点是表面结构高度有序,稳定性好,有利于杂交;但对巯基化合物修饰的DNA的纯度要求较高,分离提纯操作较烦琐。白燕[14]等人利用自组装单分子膜技术,考察了ssDNA/Au电极、dsDNA/Au电极的指示剂氧化峰电流。研究表明,ssDNA/Au电极、dsDNA/Au电极的指示剂氧化峰电流响应值之差与互补DNA浓度在一定范围内呈线性关系,据此可以识别特定序列的DNA,并对其进行定量。陆琪[15]等人采用先进行”SH化合物自组装,得到自组装单分子层,再在其上共价键合或吸附固定DNA的方法,制备DNA修饰电极,克服了由于”SH修饰的DNA难以合成,并且需要分离提纯,操作繁琐的缺点。Xu[16]等先将4_巯基丁基膦酸(MBPA)在纯乙醇中固定到硅晶片的金膜上,然后再与Al3+反应,形成一层包含Al3+的膜,再通过Al3+与DNA之间的静电作用将ssDNA固定到电极上。 　　2.3共价键结合法 　　该法首先对电极进行活化预处理,以引入活性键合基团,然后进行表面的有机合成,通过共价键合反应把探针分子修饰到电极表面。如在氧化的玻碳电极表面,以一种水溶液的乙基_(3_二甲基丙基)碳二亚胺盐酸和N_羟基磺基琥珀酰亚胺作为偶联活化剂,小牛胸腺DNA和多聚脱氧鸟苷酸、多聚脱氧胞苷酸片段通过与活化的电极表面(O_酰基异脲)形成磷酰胺键共价结合到电极表面。其特点是修饰层稳定,易进