痤疮丙酸杆菌对小胶质细胞产生TNFα、 IL1β影响.docVIP

痤疮丙酸杆菌对小胶质细胞产生TNFα、 IL1β影响 　【摘要】 目的: 探讨痤疮丙酸杆菌（P.acnes）对小胶质细胞产生TNFα、 IL1β的影响, 明确外伤后细菌性致死性肉芽肿(FBGT)致病菌P.acnes临床株、 标准株刺激机体产生细胞因子的差别。方法: 采用ELISA法、 RTPCR的方法观察标准株、 临床株对小胶质细胞产生TNFα和IL1β的影响。结果: (1)P.acnes临床株和标准株均可促进小胶质细胞产生TNFα和IL1β, 与空白对照组相比有统计学意义（P＜0.05）, 标准株较临床株有较强的刺激小胶质细胞产生TNFα的能力; (2)临床株和标准株均能促小胶质细胞进产生IL1β, 二者差别无统计学意义, 但产生IL1β的能力大于TNFα。结论: P.acnes 均可促进小胶质细胞产生TNFα、 IL1β , 但其能力不同, 说明P.acnes刺激机体早期免疫应答水平不同。 【关键词】 痤疮丙酸杆菌 小胶质细胞 IL1β TNFα 　　外伤后细菌性致死性肉芽肿(fatal bacteria granuloma after trauma, FBGT)是一种继发于面部外伤的慢性感染性致死性疾病［1］, 目前已明确其病原菌为痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acnes, 简称P.acnes)［2］, 且已证明从患者皮损内分离出的细菌并无变异。P.acnes是一种革兰阳性厌氧杆菌, 属于一种低毒力细胞内寄生菌。FBGT患者均在皮损出现后1.5至4年内死于由P.acnes导致的脑组织炎症。小胶质细胞（microglia, MG ）是重要的免疫细胞, 由其组成一个广泛的防御网, 对神经元具有支持、 营养作用［3］。MG作为脑内的抗原提 呈细胞, 表面有许多细胞因子受体和趋化性细胞因子受体, 可产生多种细胞因子和趋化性细胞因子, 能刺激T细胞活化及增殖, 启动或促进炎症反应在中枢神经系统内的进程［4］。P.acnes如何进入脑内、 为何引起如此凶险的后果等一直是大家关注的问题, 但相关研究目前是一片空白。而且对小胶质细胞产生细胞因子功能的影响尚不明确, 为了明确P.acnes 对单核巨噬细胞产生细胞因子的影响, 我们采用ELISA法、RTPCR法观察P.acnes作用于小胶质细胞后TNFα、 IL1β的产生情况。 　　1 材料和方法 　　1.1 材料 　　小胶质细胞株［ATCC(CRL2020) , 购于ATCC］, 以含100 mL/L胎牛血清（中国医学科学院生物工程研究所）的RPMI1640培养液、 IL1βELISA试剂盒、 TNFα ELISA试剂盒购自美国Hyclone公司, 在37℃、 50 mL/L CO2的孵箱中培养并传代; P.acnes标准株(编号: NCTC 737)由中国科学院微生物所刘志恒教授惠赠: 临床株来自患者皮损的分离; 用厌氧脑心浸液肉汤(BHI) 购自英国Oxiod公司培养。 　　1.2 方法 　　1.2.1 细胞培养 　　小胶质细胞体外培养含100 mL/L胎牛血清(FBS)的RPMI1640培养, 37℃、 50 mL/L CO2培养。 　　1.2.2 P.acnes 悬液的制备 　　挑取单个菌落接种于厌氧脑心浸液肉汤培养基(BHI)中, 37℃厌氧箱中静止培养, 3 d后, 麦氏比浊法计数, 用生理盐水稀释、 调整细菌密度至1×1011/L, -20℃保存, 使用前室温融化。 　　1.2.3 分组及细胞处理 　　试验分组:按照菌株分为临床株和标准株作为实验组, 生理盐水作为(空白对照组)。细胞处理:收获培养4 d的小胶质细胞, 台盼蓝排除试验证明活细胞率在95%以上。将细胞密度调整为1×109/L, 接种于24孔板, 每孔1 mL, 分别加入各组菌悬液液1 mL, 37℃、50 mL/L CO2孵育24 h , 800 r/min 离心6 min , 收集上清, -20℃保存, 使用前室温融化。 　　1.2.4 ELISA法 　　根据说明, 试剂盒平衡至室温(20℃～25℃), 配制工作液。加入100 μL标准品、 100 μL标本与相应反应孔中, 混匀30 s, 封板, 37℃温育60 min, 洗板(用洗涤液洗涤反应板, 去除水滴, 反复5次), 每孔加入100 μL生物素, 混匀30 s, 封板, 37℃温育60 min, 洗板5次, 每孔加入100 μL浓缩酶联物, 混匀30 s, 封住板孔, 37℃温育30 min, 洗板5次, 每孔加入显色液100 μL, 37℃暗处温育15 min, 每孔加入终止液100 μL,