HZ实验室免疫印迹标准方案.docVIP

Western印迹法 仪器：灭菌器、低温高速离心机、酶标仪、80℃低温冰箱、20℃/4℃冰箱、垂直平板电泳槽、转移电泳槽、伯乐电泳仪、恒温水浴摇床、恒温数控电热箱、多用脱色摇床、热封口器、恒温磁力搅拌器、电子酸度计、振荡器、万用电炉、电子天平（0.01～200、0.0001～200g各一台）。三羟甲基氨基甲烷三羟甲基氨基甲烷l，MW157.59，仅用于Stripping配方配制) 、浓盐酸、异丙醇、NaH2PO4（MW119.98）、Na2HPO4·12H2O（MW 358.14）、十二烷基硫酸钠N,N,N,N-四甲基乙二胺乙基苯基聚乙二醇乙二胺四乙酸苯甲基磺酰氟epstatin（胃酶抑素）、Leupeptin（亮肽素）、Aprotinin（抑肽酶） 试剂配制： （一）母液 严禁使用微量加样器吸取盐酸，只能用玻璃滴管 1.0 mol/L Tris·HCl Tris (MW121.14) 30.29g (121.1g) 蒸馏水 200ml (800ml) 溶解后，用浓盐酸调pH至6.8和7.4（在PH计监测下缓慢滴加），最后用蒸馏水定容至250ml(1000ml)，4℃保存。 1.0 mol/L TrisHCl Tris (MW157.6) 7.88g 蒸馏水 35ml 溶解后，用浓盐酸调pH至6.8（在PH计监测下缓慢滴加），最后用蒸馏水定容至50ml，4℃保存。 1.5mol/L Tris·HCl（pH8.8） Tris (MW121.14) 45.43g (181.7g) 超纯水 200ml (800ml) 溶解后，用浓盐酸调pH至8.8，最后用超纯水定容至250ml(1000ml)，4℃保存。 0.5mol/L Tris·HCl（pH6.8） Tris (MW121.14) 15.14g (60.57g) 超纯水 200ml (800ml) 溶解后，用浓盐酸调pH至6.8，最后用超纯水定容至250ml(1000ml)，4℃保存。 1.74mg/ml (10mmol/L) PMSF PMSF 0.0522g 异丙醇 30ml 溶解后，分装于1.5ml离心管中，－20℃保存。 0.1mol/L EDTA EDTA 0.8767g 蒸馏水 10ml 热磁力搅拌器充分搅拌pepstatin（胃酶抑素 难溶解） Pepstatin 0.005g 甲醇 14.58ml 分装，－20℃保存。避免反复冻融。 10mmol/L leupeptin（亮抑酶肽） Leupeptin 0.004g 蒸馏水 0.81ml 分装，－20℃保存。避免反复冻融。 10mg/ml aprotinin（抑肽酶） Aprotinin 0.002g 蒸馏水 0.2ml 分装，－20℃保存。避免反复冻融。 100mM NaF NaF 0.0084g 超纯水 2ml 溶解后分装，200μl/管，－20℃保存，解冻后必须1h内使用。 100mM Na3VO4 Na3VO4 0.2759g 超纯水 15ml 备注：其中Na3VO4配制活化方法如下（所有步聚均需在通风橱中进行）： 1). 配制100 mM 正矾酸钠溶液 2). 用盐酸HCl 调至pH 10.0 3). 煮沸至溶液无色，尽量减少水分挥发 4). 冷却至室温 5). 再调pH至 10.0 6). 再煮沸至无色 7). 重复上述过程，直至溶液煮沸冷却后达pH 10.0 8). 用水定容至原体