3 基因工程的基本条件-全.ppt

生物工程专业核心课程 基因工程的基本概念 A 用于核酸操作的工具酶 B 用于基因克隆的载体 C 用于基因转移的受体菌或细胞 考斯质粒与噬菌粒 噬菌粒（phagemid or phasmid） 重要的噬菌粒载体：pBluescript 体外转录载体 pBluescript = pUC + f1-ori + PT3 + PT7 2958 bp MCS lacZ’ PT7 ori Apr f1-ori pBluescript PT3 噬菌体启动子PT3和PT7强化外 源基因的转录 提取出来的单链DNA重组分子 在噬菌体RNA聚合酶的存 在下，又可实现外源基因 的体外转录 人造染色体载体 人类、动物、植物的全基因组序列分析往往需要克隆数百 甚至上千 kb 的DNA片段， 此时考斯质粒和噬菌粒载体的装载 量也远远不能满足需要。 将细菌接合因子或酵母菌染色体上的复制区、分配区、稳 定区与质粒组装在一起，即可构成染色体载体。当大片段的外 源DNA克隆在这些染色体载体上后，便形成重组人造染色体， 它能像天然染色体那样，在受体细胞中稳定的复制并遗传。 目前常用的人造染色体载体包括： 细菌人造染色体（BAC） 酵母人造染色体（YAC） 人造染色体载体 细菌人造染色体（Bacterial Artificial Chromosomes BAC） 细菌人造染色体通常是在大肠杆菌性因子F质粒的基础上 构建的，其装载量范围在50 - 300 kb之间 各种类型的pBACs在大肠杆菌受体菌只能维持单一拷贝 pBACs主要适用于： 克隆大型基因簇（gene cluster）结构 构建动植物基因文库 人造染色体载体 酵母人造染色体（Yeast Artificial Chromosomes YAC） YAC载体应含有下列元件： 酵母染色体的端粒序列 酵母人造染色体的构建： pYAC4 CEN4 EcoRI URA3 TEL BamHI TEL ori Apr TRP1 ARS1 酵母染色体的复制子 酵母染色体的中心粒序列 酵母系统的选择标记 大肠杆菌的复制子 大肠杆菌的选择标记 YAC载体的装载量为350 - 400 kb 人造染色体载体 酵母人造染色体（Yeast Artificial Chromosomes YAC） 酵母人造染色体的使用： pYAC4 CEN EcoRI URA TEL BamHI TEL ori Apr TRP ARS EcoRI EcoRI EcoRI BamHI 连接 转化酵母菌 重组酵母染色体 质粒 质粒DNA的分离纯化 实验室一般使用下列三种方法制备质粒DNA： 氯化铯密度梯度离心法 质粒DNA纯度高、周期长、设备要求高、溴乙锭污染 碱溶法 质粒DNA纯度底、快速、操作简便 沸水浴法 质粒DNA纯度、操作周期介于氯化铯法和碱溶法之间 质粒 质粒DNA的分离纯化 氯化铯密度梯度离心法： 用含有EDTA的缓冲液悬浮菌体 加溶菌酶裂解细菌细胞壁 加CsCl和溴乙锭 超速离心过夜 在紫外灯下吸取cccDNA 稀释沉淀cccDNA proteins ocDNA L-DNA cccDNA RNAs 质粒 质粒DNA的分离纯化 碱溶法： 用含有EDTA的缓冲液悬浮菌体 加溶菌酶裂解细菌细胞壁 加NaOH和SDS的混合溶液，去膜释放内含物 加高浓度的醋酸钾溶液，沉淀染色体，去除染 色体DNA及大部分蛋白质 离心取上清液，用苯酚-氯仿萃取，去除痕量的蛋白质 乙醇或异丙醇沉淀水相质粒DNA 用无DNase的RNase去除残余的RNA cccDNA L-DNA ocDNA D-DNA T-DNA 质粒 质粒DNA的分离纯化 沸水浴法： 用含有EDTA和Triton X-100的缓冲液悬浮菌体 加溶菌酶裂解细菌细胞壁 沸水浴40秒钟 离心，用无菌牙签挑去沉淀物 乙醇或异丙醇沉淀质粒DNA 噬菌体或病毒DNA 噬菌体或病毒是一类非细胞微生物，能高效率高特异性地侵染 宿主细胞，然后或自主复制繁殖，或整合入宿主基因组中潜伏 起来，而且在一定的条件下上述两种状态还会相互转化。 噬菌体或病毒的上述特性使得它们的DNA能被开发成为基因工 程的有用载体，因为： 高效率的感染性能使外源基因高效导入受体细胞 自主复制繁殖性能使外源基因在受体细胞中高效扩增 噬菌体或病毒DNA 大肠杆菌的 l 噬菌体DNA l 噬菌体的生物学特性： 生物结构 l 噬菌体是大肠杆菌的温和型噬菌体 l 噬菌体由外壳包装蛋白和l-DNA组成 l-DNA全长48502个核苷酸 l-DNA上至少有61个基因 l 噬菌体生物学特性： 生物结构 5’ TCCAGCGGCGGGG 3’ 3’ CCCGCCG