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川芎嗪抗动脉粥样硬化机制探究 　 作者：彭小春，马红莺，尹刚，魏芸 【摘要】 　　目的研究川芎嗪对氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL) 致人内皮细胞ECV304 损伤的保护作用及机制，探讨其在动脉粥样硬化防治中的意义。方法ox-LDL诱导人血管内皮细胞损伤，以0.5 mg/ml川芎嗪干预24 h，试剂盒测定细胞培养液中乳酸脱氢酶（LDH)、丙二醛（MDA)含量以及细胞中超氧化物歧化酶(SOD) 、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性。结果川芎嗪对ox-LDL诱导的血管内皮细胞诱导的损伤有明显的抑制作用，主要是显著提高了血管内皮细胞抗氧化酶SOD 、GSH-Px的活性。结论川芎嗪对ox-LDL导致內皮细胞损伤具有保护作用，机制与其抗氧化效应有关。 【关键词】 川芎嗪； 氧化型低密度脂蛋白； 动脉粥样硬化； 谷光甘肽过氧化物酶； 超氧化物歧化酶 内皮功能不全被认为是动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS) 炎症学说发病机制中的最早期事件。许多危险因素能引起内皮功能不全，诸如高胆固醇血症、高血压病、吸烟、糖尿病等［1］。但内皮功能不全的确切机制还不十分清楚。越来越多的证据显示氧化型低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein, ox-LDL) 在内皮功能不全中扮演重要角色。本实验以体外培养内皮细胞为研究对象，观察川芎嗪对ox-LDL诱导的内皮细胞损伤的保护作用及其机制，为川芎嗪在治疗动脉粥样硬化中的应用提供实验依据。 　　1 材料与仪器 　　1. 1 药物盐酸川芎嗪氯化钠溶液（100 ml∶80 mg），购于山东华鲁制药有限公司，用蒸馏水稀释成终浓度0.5 mg/ml。 　　1.2 细胞人内皮细胞株( ECV304) 购自武汉大学典藏中心。 　　1.3 试剂与仪器DMEM，胎牛血清以及胰蛋白酶购自美国Gibeco公司；乳酸脱氢酶（LDH)、丙二醛（MDA)，超氧化物歧化酶(SOD) 、谷光甘肽过氧化物酶(GSH-Px) 检测试剂盒均购于南京建成公司。兔抗人Ⅷ因子抗体购于福州迈新生物技术公司。 　　2 方法 　　2.1 内皮细胞培养和鉴定 　　常规培养ECV304细胞，待生长至融合状态后，0.25%胰蛋白酶消化，吹散、均匀接种于预置盖玻片的6孔板中，加入细胞培养液，置孵箱培养24 h取出细胞爬片。PBS洗涤两次，4％多聚甲醛固定后，细胞的鉴定采用Ⅷ因子抗原检测法、DAB染色阳性确定。 　　2.2 ox-LDL 的制备参照文献［2］ 　　分离出人血浆LDL，4 ℃置磷酸缓冲盐透析24 h，经琼脂糖凝胶电泳证实为单一区带。所得LDL经聚乙二醇(PEG) 20000浓缩4～5 倍后以Lowry’s法测定蛋白含量。0 .45 μmol/ L 滤膜过滤除菌。采用CuCl2 在室温下氧化。测定各组硫代巴比妥酸反应产物（TBARS）值，经0. 4 %的琼脂糖凝胶电泳检测 LDL氧化程度。 　　　2.3 实验分组测定其它指标的细胞，无血清培养基同步化12 h，随机分为４组：① 空白对照组（ECV304）：不加任何刺激因素；②川芎嗪对照组（ECV304＋川芎嗪）：加入终浓度为0.5 mg/ml的川芎嗪；③ox-LDL组（ECV304+ox-LDL）加入终浓度为0.1 mg/ml的ox-LDL；④川芎嗪保护组（ECV304+ox-LDL+川芎嗪）加入终浓度为0.1 mg/ml的ox-LDL和0.5 mg/ml的川芎嗪。各组细胞加入处理因素后继续培养24 h，收集细胞培养液，测定LDH、MDA含量；收集细胞检测SOD 、GSH-Px活性。 　　2.4 测定LDH、MDA 含量以及SOD、GSH-Px活性收集12 孔培养板中培养液，按照试剂盒说明书测定LDH 和 MDA含量；培养板中细胞用PBS洗2次，刮取细胞，加入冰冷PBS悬浮细胞，超声15 s，反复冻融3次，离心，按照试剂盒方法测定SOD、GSH-Px活性。 　　3 结果 　　3. 1 内皮细胞第Ⅷ因子相关抗原免疫组化鉴定 细胞呈椭圆形，多角形或不规则形，胞浆中有黄褐色颗粒存在，Ⅷ因子相关抗原鉴定反应阳性。 　　3.2 川芎嗪对ox-LDL 诱导内皮细胞损伤的保护作用细胞培养液中LDH检测表明：经ox-LDL刺激24 h后细胞分泌的LDH含量（468.34±9.46 ）U/L，明显高于未加任何处理因素的空白组（136.56±19.26）U/L。而经过终浓度为0.5 mg/ml的川芎嗪处理的药物保护组细胞分泌的LDH含量为（75.34±6.89）U/L，明显低于ox-LDL组，两者差异显著（Plt;0.05）。川芎嗪保护组较ox-LDL组MDA含量明显降低，差异有显著性（Plt;0.05 ），其中ox-LDL组MDA为（1.58±0.02） μmol/L