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In-Fusion Cloning 宝生物工程（大连）有限公司 营销部2015.8 主要内容 1 In-Fusion原理 2 In-Fusion特点 3 In-Fusion应用 4 In-Fusion FAQ Tips 5 In-Fusion实验例 2 In-Fusion原理 50 ℃，15 min单管反应 In-Fusion酶 In-Fusion Enzyme mix具有3’外切酶活性，可以在克隆片段和载体的5’末端产生大约15 nt单链 悬挂末端。单链悬挂末端在同源处退火，重组环状链在E.coli中得到重组。 3 In-Fusion特点 第四代 选择In-Fusion的理由 产品 开放性：任何载体，任何酶切位点，任何位置 无缝克隆：无任何附加冗余序列 快速：15分钟反应 高效：阳性克隆率最高95%以上 方便性：多片段克隆，单管操作，一次反应 优化套装组合：各种套装，自由选择 4 In-Fusion应用 多片段克隆 构建载体模型 应用 插入突变位点 高通量克隆 5 In-Fusion HD Cloning FAQs General Questions Q1：如何选择PCR聚合酶？ Q2：In-Fusion Enzyme稳定性如何？ A1：任何PCR聚合酶均可，最好使用高保真聚合 A2：升级后的产品（639648）可以在-20℃稳定 酶。 保存，而EcoDry （638912）可以室温稳定保存。 Q3：载体和插入DNA片段的末端结构有何限制？ Q4：任何载体都适用In-Fusion吗？ A3：没有特殊的限制，粘性末端、平滑末端、有无 A4：是的，最大做过的cosmid为46 kb，不过对 “A ”尾末端，磷酸化及非磷酸化末端都可以。 于超过10 kb的载体克隆效率会降低。 Q5：是否可以单次反应中克隆多重片段？ Q6：In-Fusion会引入序列错误吗？ A5：可以通过单次反应对多个片段进行克隆，这是 A6：不会。目前没有发现采用In-Fusion而产生碱 多片段克隆的有效方法。多片段克隆，经过成功验 基滑动、碱基添加和碱基缺失现象。超过4,000个 证最多插入5个片段，阳性克隆效率比单片段克隆 克隆测序结果显示克隆位点处几乎无任何错误。 效率低，需要筛选更多的克隆来获得目标产物。 大多数错误是由于引物合成错误导致。 Q7：In-Fusion克隆方法会导致阅读框改变吗？ A7：阅读框由引物序列决定，可以在15 bp同源序列之后，特异性序列之前添加1-2个碱基