- 1、本文档共33页,可阅读全部内容。
- 2、原创力文档(book118)网站文档一经付费(服务费),不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。
- 3、本站所有内容均由合作方或网友上传,本站不对文档的完整性、权威性及其观点立场正确性做任何保证或承诺!文档内容仅供研究参考,付费前请自行鉴别。如您付费,意味着您自己接受本站规则且自行承担风险,本站不退款、不进行额外附加服务;查看《如何避免下载的几个坑》。如果您已付费下载过本站文档,您可以点击 这里二次下载。
- 4、如文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“版权申诉”(推荐),也可以打举报电话:400-050-0827(电话支持时间:9:00-18:30)。
查看更多
实验六 质粒抽提和酶切2015
实验四 质粒DNA的提取、
酶切与鉴定
李卫芳 王秀海 陈黎
实验内容
1. 大肠杆菌质粒DNA 的分离及纯化 (碱变性法)
2.2. 质粒DNADNA 的双酶切实验
载体的设计和应用是DNA体外重组的重要步骤。
作为基因工程的载体必须具备下列条件:
①是一个复制子,载体有复制起点才能使与它结合的外源基因在受
体细胞中复制繁殖;
②载体在受体细胞中能大量增殖,有高复制率才能使外源基因在受
体细胞中大量扩增体细胞中大量扩增;;
③载体DNA链上有一到几个限制性内切酶的单一识别与切割位点,
便于外源基因的插入;
④载体具有选择性的遗传标记,如有抗氨苄青霉素(AmpR),抗卡那
霉素基因(KanR)等,以此知道它是否已进入受体细胞,也可根据这
个标记将受体细胞从其他细胞中分离筛选出来。
质粒:
质粒(plasmid):一种染色体外的稳定遗传因子,大小在1-
2OO kb之间,具有双链闭合环状结构的DNA分子,主要发现于
细菌、放线菌和真菌细胞中。
质粒具有自主复制和转录能力,能使子代细胞保持它们恒
定的拷贝数,可表达它携带的遗传信息。它可独立游离在细胞
质内,也可以整合到细菌染色体中,它离开宿主的细胞就不能
存活,而它控制的许多生物学功能也可对宿主细胞的相应缺陷
进行补偿。
• GI基因到 pTKD 质粒中的 pTKD GI质粒,
长度大约为 3 + 1.3 (kbp).
所有分离质粒DNA的方法都包括三个基本步骤
1.培养细菌使质粒扩增;
2.2.收集和裂解细菌收集和裂解细菌;;
3.分离和纯化质粒DNA。
大肠杆菌质粒DNA 的分离及纯化
(碱变性法原理)
溶菌酶:可破坏菌体细胞壁;
十二烷基硫酸钠(SDS) :可促使细胞壁裂解,经溶菌酶和阴离
子去污剂子去污剂(SDS)(SDS)处理后处理后,,变性的细菌染色体变性的细菌染色体DNADNA缠绕附着在细胞缠绕附着在细胞
壁碎片上,当以pH 4.8 的NaAc高盐溶液去调节其pH至中性时,
变性的质粒DNA又恢复原来的构型, 保存在溶液中,而染色体
DNA不能复性,随着细胞碎片等一起被沉淀。最后经乙醇沉淀、
洗涤,可得到纯的质粒DNA 。
质粒的构型与电泳迁移率
6 7
质粒DNA 的相对分子质量一般在l0 ~ 10 范围内,如质粒
6
pBR322 的相对分子质量为2.8 ×10 ,质粒pUCl9 的相对分子质量
6
为1.7 ×1O 。
共价闭环DNA (Covalently Closed Circular DNA,简称cccDNA)常
以超螺旋形式存在。
开环DNA (open circular DNA,简称ocDNA) :如果两条链中有
条链发生一处或多处断裂,分子就能解旋而消除链的张力,这种
松弛型的分子叫作ocDNA 。
线型DNA (linear DNA): 若两条链同时发生断裂,呈线性构型。
在电泳时,同一质粒如以cccDNA形
式存在,它比其开环和线状DNA 的
泳动速度快,而ocDNA 电泳阻力最
大,泳动速度最慢。因此在本实验
中中,,自制质粒自制质粒DNADNA在电泳凝胶中呈在电泳凝胶中呈
现2 ~ 3条电泳区带。要减少DNA链
的断裂,提取DNA 的操作应避免强
力吹打和震荡,要尽量轻柔。
离心机的正确使用:
平衡:
在转子的对称位置的管子等重量,小的台式
离心机则仅要求对称位置2管要有大约等体
积的溶液积的溶液
清洁:离心管盖子要盖紧,防止漏液。若有
漏液,要及时清洁,以防转子腐蚀报废。
操作流程:
本次质粒提取方法请按以下方法进行 (一种不用酚与氯仿的
质粒提取法,减少环境污染,也更安全)。
注意注意::每人收取每人收取33 mlml的菌液的菌液,,也即先取也即先取11..55 mlml,,离心去除上离心去除上
清后再取1.5 ml离心,以提高质粒的收获量。
图 质粒DNA酶
您可能关注的文档
- 宇宙学 距离阶梯与哈勃常数.pdf
- 宇宙飞行器的密封材料.pdf
- 宁波老外滩政治规划.pdf
- 安全与接口测试.pdf
- 宁夏红战略分析.pdf
- 宁夏建材集团2014年度报告.pdf
- 安全技术历年出题考试情况分布.pdf
- 安全帽正确佩戴和使用说明.pdf
- 宁波富邦_2009半年报.pdf
- 宇视上海办事处案例初版.pdf
- 人教版九年级英语全一册单元速记•巧练Unit13【速记清单】(原卷版+解析).docx
- 人教版九年级英语全一册单元速记•巧练Unit9【速记清单】(原卷版+解析).docx
- 人教版九年级英语全一册单元速记•巧练Unit11【速记清单】(原卷版+解析).docx
- 人教版九年级英语全一册单元速记•巧练Unit14【单元测试·提升卷】(原卷版+解析).docx
- 人教版九年级英语全一册单元速记•巧练Unit8【速记清单】(原卷版+解析).docx
- 人教版九年级英语全一册单元速记•巧练Unit4【单元测试·提升卷】(原卷版+解析).docx
- 人教版九年级英语全一册单元速记•巧练Unit13【单元测试·基础卷】(原卷版+解析).docx
- 人教版九年级英语全一册单元速记•巧练Unit7【速记清单】(原卷版+解析).docx
- 苏教版五年级上册数学分层作业设计 2.2 三角形的面积(附答案).docx
- 人教版九年级英语全一册单元速记•巧练Unit12【单元测试·基础卷】(原卷版+解析).docx
最近下载
- 2024年中国石油秋季招聘通用能力考试笔试备考试题及答案解析.docx
- 第一课 教室盆栽我做主—盆栽养护 课件 浙科版综合实践活动四年级上册.pptx
- 医疗安全(不良)事件根本原因分析法活动指南.pdf VIP
- 2023年中考押题预测卷02(杭州卷)-英语(考试版)A4.docx
- 于品 清华丘班数学分析讲义.pdf VIP
- 金融风险管理(中央财经大学)中国大学MOOC(慕课)章节测验试题(答案).pdf
- 一年一度喜剧大赛江东鸣《先生请出山》完整台词.docx VIP
- 党员立足本职岗位发挥党员先锋引领作用发言稿.doc VIP
- 《机床电气控制》M7130型卧轴矩台平面磨床的电气控制.pdf VIP
- Unit 4 Period 4 Developing Ideas 课件-高一上学期英语课件(外研社2019必修第一册).pptx
文档评论(0)