（单子叶植物,特别用于水稻,草铵膦抗性）.PDFVIP

北京唯尚立德生物科技有限公司 植物Cas9/gRNA 质粒构建试剂盒(Catalog. No. VK005-02) （单子叶植物，特别用于水稻，草铵膦抗性） 产品组成 组成 VK005-02S VK005-02L Cas9/gRNA Vector 5T 10T Solution1 20μL 20μL Solution2 10μL 20μL Sqprimer(10μM) 50μL 50μL 保存条件: 请将产品于-20 ℃保存，避免反复冻融 产品说明 此试剂盒能快速方便地将gRNA 靶点序列插入到Cas9/gRNA 质粒中。构建好的 Cas9/gRNA 质粒能够同时表达植物密码子优化的Cas9 蛋白及gRNA ，应用 CRISPR 技术进行目标基因的敲除和编辑。 特性：1）玉米Ubi启动子表达植物密码子优化的Cas9蛋白； 2）单子叶的3’UTR提高Cas9蛋白表达水平； 3）水稻U6启动子表达gRNA，特别适用于水稻； 4）35S启动子表达草铵膦抗性 5）多个gRNA构建到同一载体中 试剂盒使用前gRNA 靶点引物的设计与合成 请按照如下格式设计引物oligo ： Target-Sense：5’-CAG-gRNAsense Target-Anti：5’-AAC-gRNAanti 例如设计的gRNA 的靶点位置为CAGTTCTAAATAATGGCATGG (其中：识别序列大约18-20bp； 灰色背景：PAM 序列)。按照gRNA 的靶点序列设计下面的oligo，并进行合成，注意：oligo 不能加上PAM 序列。 Target-Sense：5’-CAGCAGTTCTAAATAATGGCA-3’ （正向序列） Target-Anti：5’-AACTGCCATTATTTAGAACTG-3’ （反向互补序列） 使用方法： 注意：收到试剂盒后，使用前请离心试管，避免溶液残留管壁上。 010 order@ 北京唯尚立德生物科技有限公司 步骤一：oligo 二聚体（oligoduplex ）的形成 将合成的oligo 分别稀释成10μM ，按如下比例混合 Target-Sense 5μL Target-Anti 5μL H2O 15μL 最终体系 25μL 混匀后，按照如下程序处理： 95℃3min 95℃到25 ℃缓慢冷却，例如 -1℃/20S 或者将样品管放在95℃水中，自然冷 却至室温 16℃5min 步骤二：oligo 二聚体插入到载体中 Cas9/gRNAVector 1μL 步骤一的oligo 二聚体 1μL Solution 1μL Solution2 1μL H O 6μL 2 最终体系 10μL 16℃反应2 小时。 步骤三：转化 取步骤二的最终产物5-10μL加入到刚解冻的50μL DH5a感受态细胞中，轻弹混 匀，冰浴30分钟，42 ℃热激90秒，冰上静置2分钟，然后加入500微升无抗LB，置 于37℃恒温摇床中，170转，复苏一小时后涂卡纳抗性（Kana+ ）的平板。 阳性克隆的鉴定 挑3至5个白色菌落摇菌，进行测序。这个