2014研究生自开课-免疫电镜.pdf

工作原理： 用一束极细的电子束扫描样 品，在样品表面激发出次级电子， 次级电子的多少与电子束入射角有 关，也就是说与样品的表面结构有 关。次级电子由探测体收集，并转 变为光信号，再经光电倍增管和放 大器转变为电信号来控制荧光屏上 电子束的强度，显示出与电子束同 步的扫描图像。图像为立体形象， 反映了标本的表面结构。 工作原理： 由电子枪发射出来的电子束，在真空 通道中沿着镜体光轴穿越聚光镜，通过聚 光镜将之会聚成一束尖细、明亮而又均匀 的光斑，照射在样品室内的样品上；透过 样品后的电子束携带有样品内部的结构信 息，样品内致密处透过的电子量少，稀疏 处透过的电子量多；电子束经过多级综合 放大成像，最终被放大了的电子影像投射 在观察室内的荧光屏板上，并转化为可见 光影像以供使用者观察。 镜筒 真空装置 电源柜  普通透射电镜 观察组织的一般超微结构。  免疫电镜 观察某种特定抗体标记阳性的细胞或细胞的 某一部分如细胞器的超微结构。  免疫电镜技术(immunoelectron microscopy, IEM) ： 运用免疫组织化学的基本原理，即抗原和抗体特异 性结合的原理，利用电子显微技术，在超微水平上 定位、定性以及半定量抗原的技术方法。 组织硬 包埋剂支撑 如何切这么薄？ 刀锋利 钻石刀 组织标本经过固定和树脂包埋，做成超薄切 片后，再进行免疫组化染色。优点是超微结构保 存较好，方法简便。缺点是抗原在脱水、浸透及 树脂包埋过程中可能被破坏，且抗原被树脂遮盖 不易与抗体接触，使免疫标记的阳性率下降。尤 其是后固定剂锇酸对抗原的破坏较严重，因此常 常避免使用。 先进行免疫染色，而后进行常规电镜方法处理。 优点： ⅰ.切片在免疫染色前不经过后固定、脱水及树 脂包埋的过程，抗原未被破坏，易于获得良好的免 疫反应； 先进行免疫染色，而后进行常规电镜方法处理。 优点： ⅱ. 在标记完抗原后，再经过戊二醛交联和锇 酸后固定，有利于膜结构的维持，而且抗原抗体被 更牢固的结合在一起，提高标记率； 先进行免疫染色，而后进行常规电镜方法处理。 优点： ⅲ.可在免疫反应阳性部位定位做超薄切片，提 高电镜下的检出率。 透射电镜分辨率为0.1 ～0.2nm ，可放大几万～几十万倍。 适用于细胞膜表面抗原的定位，由于其分子量较大， 不易穿透细胞膜，定位细胞内抗原较为困难。 是将酶（主要是过氧化物酶）与抗体相交联，抗原 抗体反应后，加底物显示酶的活性部位，酶反应产 物经O O （四氧化锇，锇酸）处理变为具有一定电 s 4 子密度的锇黑，可在电镜下观察。过氧化物酶的相 对分子量较小，与其交联的抗体较易穿透经处理的 细胞膜，可用于细胞内抗原的定位。但是酶反应产 物比较弥散，因此分辨率不如颗粒性标记物高。 目前应用最广的免疫电镜标记技术，该技术是将胶体金作为 抗体的标记物，用于细胞表面和细胞内多种抗原的精确定位。  1.胶体金能稳定并迅速地吸附蛋白，而且蛋白的生 物活性不发生明显改变；  2.在电镜下金颗粒电子密度高、圆形且界线清晰， 易于辨认，定位比酶反应物更精确；  3.胶体金标记物易于制备，并可以根据需要制备大 小不同（1～150nm）的胶体金，因此可进行免疫电 镜的双重或多重标记；  4.金颗粒能发射强烈的二次电子，是扫描电镜的理 想标记物；  5.胶体金经过银显影增强后，金颗粒外周吸附大量 银颗粒而呈现黑色或黑褐色，因此也能用于光学显 微镜观察。 固定——固定剂的选择  甲醛对组织渗透力强，固定迅速，起着暂时固定的作用。苦 味酸对膜性结构有较好的固定作用。戊二醛固定速度快，可 固定蛋白质、碳水化合物、糖原、糖蛋白等，且可以保存某 些酶的活性，但难以保存脂类，而且对膜结构有一定的交联 作用。  实验动物经主动脉依次