基于病毒mRNA监测的传染性脾肾坏死病毒灭活快速检验方法.PDFVIP

第41 卷 第 9 期 水 产 学 报 Vol. 41, No. 9 2017 年 9 月 JOURNAL OF FISHERIES OF CHINA Sept., 2017 文章编号: 1000-0615(2017)09-1464-09 DOI: 10.11964/jfc.20160810514 基于病毒mRNA监测的传染性脾肾坏死病毒灭活 快速检验方法建立及其应用 1 2 2 3,4 3,4 3,4 张醴溪 ， 杨圆圆 ， 方 伟 ， 付小哲 ， 林 强 ， 李 趁 ， 3,4 3,4 3 1,4 3,4* 刘礼辉 ， 梁红茹 ， 黄志斌 ， 吴志新 ， 李宁求 (1. 华中农业大学水产学院，湖北 武汉 430070; 2. 广东省水生动物疫病预防控制中心，广东 广州 510222; 3. 中国水产科学研究院珠江水产研究所，农业部渔用药物创制重点实验室， 广东省水产动物免疫技术重点实验室，广东 广州 510380; 4. 淡水水产健康养殖湖北省协同创新中心，湖北 武汉 430070) 摘要：为建立传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)灭活快速检验方法，从ISKNV 感染CPB细胞 系转录谱筛选并经qRT-PCR验证表达量最高的病毒ORF099基因作为快速检测靶基因。以 质粒pMDORF099 为标准品，采用qPCR方法绘制了C 值与质粒拷贝数的标准曲线，其线 T 性方程为C =–3.42lgx+39.455 ，最低检测限为3拷贝/μL ，结果显示组间和组内变异系数 T 均小于2% ，表明该方法具有较高的灵敏度和较好的重复性。将ISKNV病毒悬液10倍稀释 0 3 成10 ~10 拷贝/mL ，分别取1 mL病毒稀释液接种CPB细胞，在第7、9和11天提取细胞总 RNA ，经基因组DNA 去除试剂盒去除残留DNA 后采用qRT-PCR方法检测ORF099基因转 录本，结果显示在第7天即可从接种1个拷贝病毒的细胞中检测出ISKNV ORF099转录本。 将3个浓度梯度(0.05%、0.1%、0.2%) 的甲醛灭活ISKNV制备的模拟样品以及实验室制备 的3批次ISKNV 细胞灭活疫苗样品接种CPB 细胞9 d ，采用上述快速检验方法进行检测。 0.05%、0.1% 甲醛灭活模拟样品可检测到ISKNV ORF099基因转录本，其他样品均未检测 到。而细胞盲传实验显示，0.1%终浓度甲醛灭活ISKNV接种细胞盲传3代未出现CPE ，鱼 体安全实验显示接种鱼体后无临床发病症状和实验鱼死亡，表明本研究建立的病毒灭活 快速检验方法比细胞盲传法和鱼体安全实验具有更高的灵敏度，与传统检测方法相比具 有灵敏度高、耗时短、检测效率高等优点，对提高ISK