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实验十 ＤＮＡ片段从琼脂糖凝胶中的分离 DNA fragment recovery from the agrose gel 一．实验目的及背景 在生物技术实验中，ＰＣＲ反应获得的目的片段，酶切后所得特定的ＤＮＡ序列， 分子杂交中所制备的探针等，经过琼脂糖凝胶电泳后，目的片段与其它ＤＮＡ分开， 这就需要有一套方法将目的ＤＮＡ从凝胶中分离出来，通过处理后得到纯化的目的ＤＮＡ， 以用于以后分子杂交，重组子构建，序列分析等. 从凝胶中分离回收ＤＮＡ的方法 现在常用的技术有： 电洗脱法 低熔点琼脂糖凝胶法 ＤＥＡＥ滤膜插片法等 其中电洗脱法，经济节省，操作方便， 对ＤＮＡ的回收效果好。 低熔点琼脂糖凝胶法 65oC琼脂糖凝胶熔点 低熔点琼脂糖凝胶 37oC 液体 ＤＥＡＥ滤膜插片法 High efficient DNA high quality for microinjection 5kb fragment 100ng DNA fragment 10mmol/L EDTA(pH8.0) 5 minutes 0.5 mol/L NaOH 5 minutes 低盐缓冲液50mM/LTris .Cl 0.15M/L NaCl 10mM/L EDTA(pH8.0) 高盐缓冲液50mM/LTris .Cl 1M/L NaCl 10mM/L EDTA(pH8.0) 电洗脱法基本原理 将电泳分离后含目的ＤＮＡ片段的琼脂糖切割下来， 装于透析袋中，继续在高电压下电泳，这时目的ＤＮＡ会从凝胶中电泳出进入透析袋中， 由于ＤＮＡ分子量大，不能透过透析袋，从而保留于透析袋中。 取出透析袋中含ＤＮＡ的溶液， 进一步用酚、氯仿抽提纯化。 二．实验试剂及仪器 NaHCO3 2% EDTA-Na2 0.01M TBE电泳液 10.8g Tris碱 0.93g EDTA 5.5g 硼酸 调pH8.2 定容1000ml 琼脂糖 透析袋 ＴＥ 酚 氯仿 乙醇 三、实验方法 一、透析袋的处理： １．切取适当长度适析袋。 ２．在２％NaHCO3 1mM EDTA溶液中煮沸１０分钟。 ３．弃去煮沸液，加无菌水内外反复洗净透析袋。 二、电洗脱 １．在长波紫外灯下（３００－３６０nm ）将含目标ＤＮＡ片段的凝胶条带切下装入透析袋中。 ２．向透析袋内加入２ml电泳缓冲液，使之浸没凝胶，并排空汽泡。 ３．将透析袋水平放入电泳槽（长度方向与电泳平行）， 加入适量缓冲液将透析袋浸没（约６－７mm）。 ４．接通电源，１５０伏电洗，在紫外灯下观察待ＤＮＡ全部移出凝胶。 ５．改变电场方向继续通电１分钟。 ６．从透析袋中吸出缓冲液于１－５ml Eppendorf管中。 ７．加入１．５倍体积正丁醇，混匀抽提去ＥＢ。 ８．在台式离心机上最高速２分钟。 ９．吸去上层，正丁醇溶液。 １０．重复７，８，９二次。 １１．自下层言ＤＮＡ的溶液中加入等体积酚氯仿（２个）抽提２次。 １２．上清转入另一Eppendorf管中加入1/10倍体积3M NaAc ２倍体积预冷无水乙醇，于２０℃过夜。 １３．12000g，4℃下离心１０分钟，得ＤＮＡ沉淀。 １４．弃上清，加入７０％乙醇洗涤２次后弃干乙醇。 １５．加入５０μl ＴＥ溶解ＤＮＡ。 １６．取１０μl ＤＮＡ溶液加入2μl Loading buffer于０．８％琼脂糖上， ４０伏电泳，３小时。 １７．在紫外透射仪上观察结果。 １８．测定ＤＮＡ溶液OD260,OD280值。 结果与分析 １．计算ＤＮＡ回收效率，判断ＤＮＡ纯度。 ２．记录电泳结果 问题与讨论： １．电洗脱过程后，为什么要反向电泳１分钟？ ２．电洗脱后的ＤＮＡ如何去除ＥＢ？ 玻璃奶法快速纯化回收DNA片段 本方法有多种用途，主要包括： 从琼脂糖凝胶中分离纯化DNA片段； 从DNA反应物中纯化目的DNA片段，如回收纯化PCR产物、酶切连接反应中的DNA片段； 从探针制备反应物中去除未标记上的核苷酸以及小的DNA片段（比如引物）； DNA浓缩、去盐及去除杂质。 本试剂盒的主要成分“基因纯”试剂是无毒、无味、无腐蚀作用的白色颗粒，能专一性结合0.2kb到50kb大小的DNA（双链或单链，线性、环状或超螺旋），不结合RNA、蛋白质、寡聚核苷酸、有机溶剂、去污剂及其它可能抑制酶活性的有机或无机物。 使用本法回收DNA片段有以下优点： 高纯度：回收的DNA片段基本上不含RNA、蛋白质及其它有机分子，可直接用于酶切、连接、探针制备、序列测定等； 简便：所需主要仪器是一架台式离心机； 快速：整个回收过程只需半个小时； 高效：回收得率达到70%