SDS聚丙烯酰胺凝胶理论.pptVIP

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）测定蛋白质分子量 一. 实验目的 学习SDS测定蛋白质分子量的原理。 掌握垂直板电泳的操作方法。 运用SDS测定蛋白质分子量及染色鉴。 熟悉蛋白印迹技术原理和方法 二. 实验原理 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳:是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基磺酸钠） 1967年，Shapiro等人首先发现，如果在聚丙烯酰胺凝胶电泳(聚丙烯酰胺凝胶中主要取决于三种因素：蛋白大小，形状和电荷)系统中加入一定量的十二烷基硫酸钠（SDS），则蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于蛋白质的分子量大小 SDS的作用 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基磺酸钠）， SDS能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂能使半胱氨酸之间的二硫键断裂，蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的SDS溶液中，与SDS分子按比例结合，形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物，这种复合物由于结合大量的SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异，由于SDS与蛋白质的结合是按重量成比例的，因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度主要取决于分子大小。 二. 实验原理 当蛋白质的分子量在15,000－200,000之间时，样品的迁移率与其分子量的对数呈线性关系。 符合如下方程式：Lg MW =－b ? m R + K 其中，MW 为蛋白质的分子量，m R 为相对迁移率，b为斜率，K为截距。当条件一定时，b与K均为常数 若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。 二. 实验原理 PAGE根据其有无浓缩效应，分为连续系统和不连续系统两大类。 连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。 不连续系统中由于缓冲液离子成分，pH，凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。 影响蛋白质和 SDS 结合的主要3个因素 1）二硫键是否完全被还原： 只有在蛋白质分子内的二硫键被彻底还原的情况下， SDS 才能定量地结合到蛋白质分子上去，并使之具有相同的构象。—般以巯基乙醇作还原剂。在有些情况下，还需进一步将形成的巯基烷基化，以免在电泳过程中重新氧化而形成蛋白质聚合体。 2）溶液中 SDS 的浓度： 溶液中 SDS 的总量，至少要比蛋白质的量高 3 倍，一般需高达 10 倍以上。当溶液中SDS单体浓度大于1mmol/L时大多数蛋白质与SDS结合的重量比为1:1.4，如果单休浓度降到0.5 mmol/L以下时，两者的结合比仅为1: 0.4这样就不能消除蛋白质原有的电荷差别，为保证蛋白质与SDS的充分结合，它们的重量比应该为1:4或1:3。 3）溶液的离子强度： 溶液的离子强度应较低，最高不能超过 0.26 ， 因为 SDS 在水溶液中是以单体和分子团的混合体而存在， SDS 结合到蛋内质分子上的量，仅决定于平衡时 SDS 单体的浓度而不是总浓度，在低离子强度的溶液中， SDS 单体具有较高的平衡浓度。 三. 注意事项 用SDS测蛋白质Mr时应注意以下问题： 1 ). 如果蛋白质 -SDS 复合物不能达到 1.4 SDS ／ lg 蛋白质的比率并具有相同的构象，就不能得到准确的结果。 2 ). 不同凝胶浓度适用于不同的 Mr范围， Weber 的实验指出，在 5% 的凝胶中， M r 为 25 000-200 000 的蛋白质 ，其 Mr的对数与迁移率 呈直线关系；在 10 ％的凝胶中， M r 为 10 000-70 000 蛋白质 ，其 Mr的对数与迁移率 呈直线关系；在 15 ％的凝胶中， Mr为 10 000-50 000 蛋白质，其 M r 的对数与迁移率呈直线关系； 3.33 ％ ( 以上各种浓度的凝胶，其交联度都是 2.6%) 的凝胶可用于 Mr更高的蛋白质。 3 ). 许多蛋白质，是由亚基 ( 如血红蛋白 ) 或两条以上肽链 ( 如胰凝乳蛋白酶 ) 组成的，它们在 SDS 和疏基乙醇的作用下，解离成亚基或单条肽链。因此，对于这一类蛋白质， SDS- 凝胶电泳测定的只是它们的亚基或单条肽链的 M r ，而不是完整分子的 Mr 。 为了得到更全面的资