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显微技术 显微镜的分辨率 显微镜物象是否清楚不仅决定于放大倍数，还与显微镜的分辨率有关， 它是决定观察效果的最重要的指标。 分辨率（Resolution，R) 指的是显微镜能够分辨两点之间最小距离能力。能够分辨的距离越小，分辨率越高，反之越低。 分辨率有镜口率决定 物镜分辨率+聚光器镜口率 有效镜口率 = ----------------------- 2 依据德国理学家Ernst Abbe，在19世纪70年代建立的在Abbe的公式中，两物体之间的最小可分辨距离被称为最小距离（d） 0.61λ 最小可分辨距离： d = —————— n sin θ 公式解析： （l）所用光源的光波波长（λ），是影响最小可分辨距离的最主要因素。可见光光线的波长为400-700nm，，其中蓝光的波长最短（400-500nm），最小可分辨距离最小，所提供的分辨率最高（所以为什麽大多数显微镜的滤光片都是蓝色的）。 （2）θ: 为物镜镜口角的半数，它取决于物镜的直径和工作距离。 （3）n：玻片（样品）与物镜间介质的折射率(空气：干燥物系；香柏油：油浸物系)。 （4）n sinθ : 被称为数值口径（Numerical Aperture, NA)，它是决定物镜性能的最重要的指标。 分辨率从定义上讲，与可分辨的最小距离（d）成反比，可表示为：Ｒ(（１／ｄ）。以这种方式将最小可分辨距离与分辨率作为两个概念分开理解，比较容易理解提高分辨率的相关措施（获得最小分辨距离 ( 提高分辨率）： （1）减短光波波长（λ）。 （2）增加镜口角(θ),这是增加数值口径的因素之一。 （3）增加介质的折射率(n)，这是增加数值口径的重要因素。如，利用油镜进行显微观察时，以香柏油取代空气，其重要作用就是提高介质折射率，使数值口径和分辨率均得到提高，同时香柏油与玻璃的折射率相近，使得很多原来在透镜和载玻片表面因折射和反射而损失的光线可以进入物镜，提高照明亮度，改善观察效果。 显微镜分类 明视野显微镜 明视野显微镜即常用的普通光学显微镜，其照明光线直接进入视野，属透射照明。生活的细菌在明视野显微镜下观察是透明的，不易看清。解决的措施，一方面是对观察的样品进行改造，发展出各种染色技术，通过特殊的染色方法使细胞着色，增加与背景的反差，便于观察；另一方面进行显微镜的改造，由此发展出不同种类的显微镜，适用于不同的观察目的。 暗视野显微镜 暗视野显微镜则利用特殊的聚光器遮挡中心光源，实现斜射照明，使照射到样品上的透射光线无法进入物镜，但由样品反射或折射的光线进入物镜，因此，整个视野是暗的，而样品是明亮的，由此达到增加反差，便于观察的目的。并且，使用暗视野显微镜，即使所观察微粒的尺寸小于显微镜的分辨率，仍然可以发现其存在。 相差显微镜 光波的长短表现为颜色差别，光的振幅高低表现为明亮程度的不同。观察样品各部分厚薄、密度不同，光线通过时直射光和衍射光的光程产生差别，导致出现相位差。相差显微镜配备了特殊的光学装置，利用光的干涉现象，将光的相位差转变成人眼可辨的振幅差（明暗差），形成反差，从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见，因此相差显微镜很适合观察活的细胞以及细胞内的一些细微结构。相差显微镜实现这一目的的特殊的光学装置主要是环状光圈和相板。 荧光显微镜 紫外线光源照射在具有荧光素的样本上，荧光素激发出荧光，使标本在暗的视野中显现出光亮的物体，不同的荧光素还表现为不同的颜色，由此可以进行定性和定量的研究。主要应用于免疫学、环境微生物学和分子生物学等方面。加装滤光片。 透射电子显微镜与扫描电子显微镜 电子显微镜与光学显微镜的差异： 1） 以电子波(波长最短可达到0.005 nm)代替光源，由于波长的极大缩短而大大提高了分辨率。光镜的最高分辨率可达到0.2μm，这种局限是由可见光的性质决定的，与显微镜自身的性能无关。电镜实际的分辨率比光镜提高约1000倍。 2）电镜镜筒中要求高真空（在电子的运行中如遇到游离的气体分子会因碰撞而发生偏转，导致物象散乱不清）。电子显微镜因需在真空条件下工作，所以很难观察活的生物。 3）以电子透镜（电磁圈）代替光学透镜，通过电磁圈使电子“光线”汇聚、聚焦。 4）电子像人肉眼看不到，需用荧光屏来显示或感光胶片作记录。 电子显微镜按结构和用途可分为： 透射电子显微镜(transmission electron microscope): 电子束穿过薄切片 扫描电子显微镜