实验三质粒提取.ppt

实验三 质粒提取与电泳 【实验目的】 通过本实验学习和掌握碱裂解法提取质粒的方法。 【实验原理】 碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。在pH值介于12.0-12.5这个狭窄的范围内，线性的DNA双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕，仍会紧密地结合在一起。当加入pH值4.8的乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此，复性迅速而准确，而线性的染色体DNA的两条互补链彼此己完全分开，复性就不会那么迅速而准确，它们缠绕形成网状结构，通过离心，染色体DNA分子与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。 【仪器、材料与试剂】 (一) 仪器 1.恒温培养箱 2.恒温摇床 3.台式离心机 4.高压灭菌锅 5.电泳仪、电泳槽 6.分光光度仪 7.凝胶成像系统 (二) 材料 1.葡萄糖 2.三羟甲基氨基甲烷（Tris） 3.乙二胺四乙酸(EDTA) 4.氢氧化钠 5.十二烷基硫酸钠(SDS) 6.乙酸钾 7.冰乙酸 8.氯仿 9. 乙醇 10．胰RNA酶 11．氨苄青霉素 12．蔗糖 13．溴酚蓝 14．酚 15. 含pUC19质粒的大肠杆菌 16．吸头、小指管 (三) 试剂 1. 溶液I 50 mmol/L 葡萄糖 25 mmol/L 三羟甲基氨基甲烷（Tris）Tris·HCl (pH8.0) 10 mmol/L 乙二胺四乙酸(EDTA) (pH8.0) 2. 溶液II 0.4 mol/L NaOH, 2% SDS, 用前等体积混合 3. 溶液III 5mol/L 乙酸钾 60 mL 冰乙酸 11.5 mL 水 28.5 mL 4. TE缓冲液 10 mmoL/L Tris·HCl (pH8.0) 1 mmoL/L EDTA (pH8.0) 5. 70%乙醇 (放-20℃冰箱中,用后即放回) 6. 胰RNA酶 将RNA酶溶于10mmoL/L Tris·HCl(pH7.5)、15mmoL/L NaCl中, 配成10mg/mL的浓度, 于100℃加热15min, 缓 慢冷却至室温,保存于-20℃。 7. 凝胶加样缓冲液（6X）：40%蔗糖、0.25%溴酚兰。 【实验步骤】 1. 将2 ml含相应抗生素（Amp：50μg/mL）的LB液体培养基加入到试管中，接入上述的含pUC19质粒的大肠杆菌，37℃振荡培养过夜。 2. 取1.5 mL培养物倒入微量离心管中，4000 r/min离心2min。 3. 吸去培养液，使细胞沉淀尽可能干燥。 4. 将细菌沉淀悬浮于100μL溶液Ⅰ中 (此处可加5μL 浓度为10μg/μL RNase A处理RNA，在后面TE中就不必加RNase A), 充分混匀，室温放置10 min。 5. 加200μL溶液Ⅱ（新鲜配制），盖紧管盖，混匀内溶物，将离心管放冰上5 min。 6. 加入150μL溶液Ⅲ（冰上预冷），盖紧管口，颠倒数次使混匀，冰上放置15 min。 7. 12000 r/min离心15min，将上清转至另一离心管中。 8. 向上清中加入等体积酚:氯仿（1:1）或氯仿:异戊醇(24:1)（去蛋白），反复混匀，12000 r/min离心5 min，将上清转移到另一离心管中。 9. 向上清中加入2倍体积无水乙醇，混匀后，室温放置5～10 min。12000 r/min离心5 min。倒去上清液，把离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体。 10. 用1 mL 70％乙醇洗涤质粒DNA沉淀，振荡并离心，倒去上清液，真空抽干或空气中干燥。 11. 加50μL TE缓冲液，(其中含有20μg/mL的胰RNA酶)，使DNA完全溶解，-20℃保存。 12. 紫外分光光度计测定DNA样品浓度(1μL DNA + 49μL H2O)。 13. 电泳检测DNA样品(1-2μL DNA + 1μL loading buffer + 3-4μL H2O) 【实验结果】 1. 根据测定的样品在260 ?的OD值，计算样品DNA浓度， 2. 在紫外光下观察到在凝胶上约2.7 kb处有条带，即pUC19质粒。 【实验安排】 本实验在一天内完