辅仁大学生命科学系细胞学实验请尊重智慧财产权禁止复制或拷贝.PDFVIP

輔仁大學生命科學系輔仁大學生命科學系 輔仁大學生命科學系輔仁大學生命科學系 細胞學實驗細胞學實驗 細胞學實驗細胞學實驗 請尊重智慧財產權請尊重智慧財產權 請尊重智慧財產權請尊重智慧財產權 禁止複製或拷貝禁止複製或拷貝 禁止複製或拷貝禁止複製或拷貝 酵素免疫測定法 Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA ELISA 是一種免疫測定法 (Immunoassay, IA) 抗原或抗體的固相 抗原或抗體的酶標記 定性定量分析 Ag+Ab→→Ag·Ab →→ 抗原抗體的結合實質上只發生在抗原的抗原決定位 與抗體的抗原結合位點之間 。 由於兩者在化學結構和空間構型上呈互補關係 ， 所以抗原抗體反應具有高度的專一性(specificity) 。 抗原抗體反應的這種專一性使免疫測定能在一 非常復雜的蛋白質化合物(例如血清)中測定某一特 定的物質 ，而不需先分離待檢物 。 最適比例 敏感性敏感性 敏感性敏感性 化學化學比色法的敏感度比色法的敏感度為為mg/ml 化化學學比色法的敏感度比色法的敏感度為為 酶反應測酶反應測定法的敏感度定法的敏感度約為約為5-10 μμg/ml 酶酶反應測反應測定法的敏感度定法的敏感度約為約為 μμ 標記標記的免疫敏感度可提高的免疫敏感度可提高數千倍數千倍 ，達，達ng/ml 標記標記的免疫敏感度可提高的免疫敏感度可提高數數千倍千倍 ，，達達 ELISA 三個三個必要的必要的試劑試劑 ：： 三三個個必要的必要的試劑試劑 ：： （（1）固相的抗原或抗体）固相的抗原或抗体 ，即，即“免疫吸附免疫吸附劑劑 （（immunosorbent）） （（ ））固相的抗原或抗体固相的抗原或抗体 ，，即即 免疫吸附免疫吸附劑劑 （（ ）） （（2）酶）酶標記標記的抗原或抗体的抗原或抗体 ，稱為，稱為“結合物結 合物 （（conjugate ）） ；； （（ ））酶酶標記標記的抗原或抗体的抗原或抗体 ，，稱為稱為 結結 合物合物 （（ ）） ；； （（3）酶）酶反反應應的的基質基質 。。 （（ ））酶酶反反應應的的基質基質 。。 indirect ELISA的原理 coating 將抗原或抗 體固定的過程稱為coating 。 蛋白質與plate是通 過物理吸附結合的 ，靠的是蛋白質 分子結構上的疏水基團與固相載體表面的疏水基團間的 作用 。 Wash 達到分離游離和結合物質的目的 清除殘留在板孔中游離的物質，以及非專一性吸附的干 擾物質 在ELISA操作中 ，洗滌是最主要的關鍵技術 Wash buffer 在在ELISA中，中 ，常用的稀常用的稀釋液釋液為為含含0.05%Tween-20 在在 中中 ，，常用的稀常用的稀釋釋液液 為為含含 磷酸磷酸鹽緩衝鹽緩衝液。液 。 磷酸磷酸鹽緩衝鹽緩衝液液 。。 indirect ELISA的原理 indirect ELISA • 一抗 ，認得抗原的抗體 • 二抗 ，認得一抗的抗體，通常會連接著detection reagent ，isotope or enzyme • Enzyme和substrate 作用後會呈色 ，測其吸光值可回推抗 原的量 Bloc