16SrRNA序列分析技术对临床标本中疑难细菌的鉴定.pdfVIP

·1000 · 安徽医科大学学报　 Acta Universitatis MedicinalisAnhui　 2015 Jul;50(7) 16S rRNA序列分析技术对临床标本中疑难细菌的鉴定 叶乃芳,凌华志,黄　 颖,沈继录,徐元宏,王中新 摘要　 目的　 应用 16S rRNA 序列分析技术鉴定临床少见 型;③ 菌株分离部位特殊;④ 生长缓慢、全自动细 或疑难细菌,提高细菌鉴定的准确性。 方法　 收集临床少见 菌鉴定系统鉴定耗时较长、可信度低或无鉴定结果 或疑难细菌44株,提取 DNA,采用通用引物进行 PCR扩增 的细菌。 标准菌株 ATCC 29213 金黄色葡萄球菌、 及目的片段基因测序,并将测序结果在核酸数据库中比对分 ATCC25922大肠埃希菌、ATCC 27853 铜绿假单胞 析以确定菌种。 结果　 44株临床少见或疑难细菌均扩增到 菌、ATCC 17666 嗜麦芽窄食单胞菌、ATCC29212粪 16SrRNA 目的基因片段并成功测序,40 株(90．9%)鉴定到 肠球菌来评价16S rRNA序列分析鉴定细菌的准确 “种”,4株(9．1%)鉴定到“属”;其中常规方法与测序方法 在“属”水平一致的有 34 株(77．3%),不一致的有 10 株 性 。 所有菌株保存于-80 ℃冰箱。 (22．7%)。 结论　 16S rRNA序列分析技术可以准确、快速 1.2　 试剂与仪器　 Mueller-Hinton Broth 肉汤(英国 地鉴定临床少见或疑难细菌,可以作为临床细菌鉴定的重要 OXOID公司);细菌DNA抽提试剂盒与PCR扩增试 方法之一。 剂盒(上海生工生物公司);DL 2 000 DNA Marker 关键词　 16S rRNA基因;序列分析;细菌;鉴定 (日本TaKaRa公司);PCR扩增仪(德国Biometra公 中图分类号　 R446.5 司);凝胶成像仪(美国 Bio-Rad 公司);VITEK 2 文献标志码 A 文章编号 1000-1492(2015)07-1000-04 COMPACT全自动细菌鉴定系统及配套 GN、GP、 NH、ANC鉴定卡片(法国生物梅里埃公司);电泳仪 　 　 随着人口老龄化、抗生素不恰当使用、免疫抑制 (北京六一仪器厂)。 剂应用及细菌培养条件的不断改进,临床标本培养 1.3　 细菌总DNA 提取　 将全自动细菌鉴定系统 出越来越多用常规方法难以鉴定的细菌。 如何对这 鉴定过的纯菌落接种于配置好的Broth 肉汤37 ℃ 类细菌进行准确快速地鉴定,是临床微生物室的一 摇菌过夜,取过夜菌液室温8000 r/ min离心1min, 项重要任务。 人类基因组计划的完成以及后基因组 取沉淀按照细菌基因组DNA抽提试剂盒步骤提取 计划的实施,利用恒定区序列设计通用引物扩增 细菌DNA。 16S rRNA基因片段的方法已经日趋成熟,并广泛应 [1]