植物（烟草）吡哆胺—吡哆醛转换反应作用酶的分离纯化及表征.pdfVIP

摘要 维生素 B (VB )是一种水溶性维生素，游离型为吡哆醇(Pyridoxine, PN)、吡哆胺 6 6 (Pyridoxamine, PM)和 吡 哆 醛 (Pyridoxal, PL)， 相 应 磷 酸 酯 形 式 为 磷 酸 吡 哆 醇 (Pyridoxine-5’-phosphate, PNP)、磷酸吡哆胺(Pyridoxamine-5’-phosphate, PMP)和磷酸 吡哆醛(Pyridoxal-5’-phosphate, PLP)。其中 PLP 是 VB 的主要辅酶形式，参加催化涉 6 及氨基酸的各种代谢反应，在其他多种物质的合成和代谢过程中也发挥着重要作用。 PM- PPAT PM- PM PL 丙酮酸转氨酶（ ）和 草酰乙酸转氨酶可以催化 与 之间的相 互转化反应，同时，谷草转氨酶(GOT)在脱去辅酶 PLP 后，可以催化 PM与 PL之间 的转化反应，但是这些都只是在微生物和动物中被证实，植物中同样存在 PM与 PL 之间的相互转换，但是作用酶尚不明确。 烟草作为一种模式植物，广泛用于植物生理生化的研究。本文以烟草为材料，对 烟草体内的 GOT和 PPAT进行分离纯化，为植物体内 VB 的代谢途径的研究奠定基 6 础。 本文采用硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow 阴离子交换、Sephadex G-100 凝胶过滤等步骤，对烟草 GOT进行纯化，结果显示：GOT被纯化了 102.66倍。GOT 为 PLP依赖型酶，本文研究表明 PLP存在时 GOT并不催化以吡哆胺为底物的转氨反 应，但去除 PLP 后，GOT可以催化以吡哆胺和草酰乙酸为底物的转氨反应；而以 L- 天冬氨酸和 a-酮戊二酸为底物时，GOT活性随 PLP 释放量增大而减小，这与动物中 GOT的性质相同。 因此本文采用同样的纯化方法对烟草PPAT进行纯化，并对其酶学性质进行了分 析。结果显示：PPAT被纯化了82.79倍。以PM和丙酮酸为底物，纯化最后一步的PPAT PM PL 酶液仍表现出较大活性，可初步认定植物体内，催化 与 之间的相互转换的转氨 酶为PPAT。对PPAT的部分酶学性质分析发现β-巯基乙醇和EDTA会抑制酶活力，其中 -1 -1 β-巯基乙醇几乎使酶失活，酶促反应的V 为4.545 μmol·L ·min ，PM和丙酮酸K 值 max m 分别为2.465μmol·L-1 和1.537μmol·L-1。 :: 关键词:: 烟草；谷草转氨酶；吡哆胺-丙酮酸转氨酶；纯化；性质 I Abstract Vitamin B (VB ) is a group of water-soluble vitamin, including the free forms of 6 6 Pyridoxine(PN), Pyridoxamine(PM), Pyridoxal(PL) and the phosphate forms of Pyrido- xine-5’-phosphate(PNP), Pyridoxamine-5’-phosphate(PMP), Pyridoxal-5’-phosphate(PLP). PLP acts as the essential coenzyme in ma