pGEMXT Easy 载体连接试剂盒.pdfVIP

◆ pGEMX -T Easy 载体连接试剂盒 ◆ 目录号 1703 ◆ 使用手册 ◆ 实验室使用，仅用于体外 pGEMX- T Easy 载体连接试剂盒 目录号：1703  试剂盒组成、储存、稳定性： 20 次 60 次 20 次 60 次 组成 ( 170301) ( 170302) ( 170303) ( 170304) pGEMX-T Easy vector （30ng/l） 20 l 60l 20 l 60l 1000bp Control （30ng/l ） 5l 5l 5l 5l 10 PEG Enhancer 50l 150l 50l 150l 2 Quick Ligation Buffer 100l 300l 10 x Ligation Buffer 40l 120l T4 DNA ligase, 5U/l 100U 300U 储存：－20℃ 保存，载体反复冻融至少10 次不影响使用质量。  产品介绍： 许多高温DNA聚合酶，如Taq DNA聚合酶、Tth DNA聚合酶等扩增的PCR产物在3’ 末端后都带有一个突出的碱基A ，这样的PCR产物可以用3’末端后带有一个突出碱基T 的载体方便地进行克隆。传统的pGEM -T Easy 载体使用ECOR V切开后加T而成，由于 加T不完全或者T头不稳定容易造成自连背景高和克隆效率不稳定。pGEMX-T Easy 载 体通过将传统的pGEM -T Easy 载体来源质粒ECOR V酶切位点改造为两个连续的XCM I 酶切位点，XCM I 酶切后其多克隆位点两侧的3 ’末端直接产生未配对的T碱基而成， 因此有更高的重组效率。同时除了对ECOR V改造外，传统的pGEM -T Easy 载体的序 列和优点完全得到保留，例如两端独特设计的两个ECOR I位点使插入片段可以用廉价 高效的ECOR I单酶切检测；可以用T7和SP6启动子引物对PCR产物进行测序等等。此 外，本公司载体连接体系还有背景低（蓝斑小于10%），重组率高（白斑中超过90%有 插入片段），可快速连接等特点。 说明书末列出了pGEMX-T Easy 载体相关的技术资料，其全序列可参照传统 - 1 - pGEM -T Easy 序列，只是其ECOR V 酶切位点替换成了两个连续的XCM I 酶切位点。  操作步骤： 1. 连接反应的准备： PCR产物是否要进行纯化取决于扩增产物的质量。如果PCR产物非常干净，不经纯 化就可直接进行连接反应。但如果是以质粒为模板的PCR产物则必须进行纯化，模 板质粒有可能也形成白斑。PCR产物可以通过琼脂糖凝胶电泳分离。本公司生产的 DNA产物快速纯化回收试剂盒对70bp 以上的DNA片段能很好地进行回收。 Taq、Tth、AmpliTaq 、KlenTaq DNA聚合酶扩增的PCR产物，其末端都带有一个突 出的3’ A 。Taq酶和Pfu 、Pwo 、Tli或Deep vent 等具有35 ’外切酶活性的DNA 聚合酶混合扩增的产物末端可能带有3’ A 。具有3’ A末端的PCR产物可以直接用 pGEMX-T Easy 载体进行克隆连接。具有3’5 ’外切酶活性的DNA聚合酶扩增的 PCR产物是平末端，要对这种平末端PCR产物进行克隆，应先进行3’端加A工作。 2. 常规连接反应： 1) 在一个标准的