第08课：研究生讨论班.docVIP

猪体细胞核移植的研究进展 体细胞克隆是将供体细胞核移入去核的卵母细胞中， 使后者不经精子穿透等有性过程即被激活、 分裂并发育， 让核供体的基因得到完全复制，经过体外培养后，将发育良好的胚胎移植到动物体内的技术[1]。近年来，体细胞克隆猪在建立人的动物疾病模型和人类器官移植，进行基因工程药物生产和临床医学克隆治疗等方面具有巨大的应用潜力，己成为当今体细胞克隆研究的热点。 1 国内外体细胞克隆猪的研究现状 1997年“多莉”羊诞生，揭开了体细胞克隆的序幕。2000年，Polejaeva 等得到首例体细胞克隆猪之后，Onishi，Bet-thauser等，相继分别成功地得到了体细胞克隆猪。2003年，Sanghwan等克隆出了表达强荧光蛋白的转基因猪。Jagdeece等克隆出了敲除α- 1，3- 半乳糖苷转移酶基因的克隆猪，从而为人类培育异种器官移植猪跨进了一大步。在国内，窦忠英等(1995)用胚胎细胞核移植产生6头猪；魏庆信等(1996)得到了胚胎细胞核移植猪；李光鹏等(1998)把猪体细胞胚胎的细胞核通过电融合移植到去核的体内和体外成熟卵母细胞中，出生了2头克隆猪。孙兴参等获得了猪卵丘细胞克隆囊胚。2003年冯秀亮得到了人体细胞和猪卵母细胞异种核移植囊胚[2]。尽管如此，猪的体细胞克隆效率很低，与其他动物相比核移植难度更大，这是因为猪的卵子体外成熟胞质成熟不完全，发育能力不如体内获得的卵子:胞质较黑，较难显微操作;胞质内富含脂滴，对温度极其敏感;至少需要四枚优质胚胎才能建立和维持妊娠等。许多有关环节的机制还不清楚。本文就影响猪体细胞核移植主要因素的研究进展情况进行了综述。 2 供体细胞 2.1供体细胞的来源 多种组织来源的体细胞如乳房上皮细胞、各种成纤维细胞、卵丘/颗粒细胞、输卵管上皮细胞、巨噬细胞、淋巴细胞、睾丸支持细胞、神经细胞都可以用于克隆动物，但来源于不同组织或细胞种类的细胞的重编程能力和核移植效率明显不同。有些种类的供核细胞虽然能够得到克隆囊胚，但没有获得克隆后代。以克隆猪为例，目前只有猪的胎儿成纤维细胞和卵丘/颗粒细胞作为供体细胞成功地获得了核移植后代。Keefer CL（2002） 等比较了不同组织来源的体细胞作为供核细胞，在山羊克隆过程中对核移植后胚胎发育潜能的影响。其中，成年山羊颗粒细胞作为供核细胞得到7.7%的产仔率，而以胎儿成纤维细胞做为供核细胞则得到3.7%的产仔率，明显低于颗粒细胞克隆效率。张德福（2006）等对比了成纤维细胞、颗粒细胞、输卵管上皮细胞等，发现成纤维细胞和颗粒细胞形成重构胚后囊胚发育率较高。Kato Y（2000）等分别以雌性牛的卵丘细胞、输卵管、子宫细胞、雌性牛及雄性牛的皮肤细胞、雄性牛的耳成纤维细胞及肝细胞为供核细胞，共得到24只克隆牛。当以子宫、皮肤、耳部和肝脏细胞作为供核细胞时，19只出生克隆牛中有9只牛的体重超过正常范围的 40%；当以卵丘或输卵管细胞为供核细胞时，新生小牛无形态异常现象，其初生重也在正常范围内[3]。 2.2 供体动物年龄 多数研究表明，在核移植过程中，采用来源于胚胎和新生动物的细胞作为供核细胞，其克隆胚胎具有相似的囊胚发育率，但胎儿细胞却更容易得到健康的新生动物。这可能是由于胎儿细胞的分化程度较低，在重组胚中更容易启动重编程。而成体动物由于年龄较大，体细胞分化程度高，积累了较多的损伤和突变，因此导致重组胚胎发育能力降低。但也有研究认为，体细胞克隆胚胎的发育率与供体细胞动物的年龄无关，如在牛的体细胞核移植中，采用2-16 岁的牛体细胞的克隆效率差异不大。但 Kato（2000）也用来自成体牛的细胞作为核供体，重组胚胎经移植后更容易在受孕后期发生早产，并且出生的小牛有缺陷的比率较高。有研究发现，体细胞核移植供体细胞的代数对核移植的效率存在一定的影响 (Kubotaetal，2000)，牛供体细胞传代多次后有助于克隆胚胎的发育。在1-10代内不影响猪重构胚的发育能力(张运海，2005)。有研究大于10代以上的供体细胞比10代以下的供体细胞的重构胚发育能力低 (LEESAB-SANG，2003)。大多数，所采用的供体细胞多数是来源于传代3-9代的细胞作核供体 (Wilmutetal， 1997;Kato et al，1998;wells et al，1999;Hill et al,2000;Reggso et al，2001)。采用传代早期的细胞，这样似乎更有利于核移胚的发育。张运海博士研究表明采用6一9代的供体细胞重构胚的发育能力较佳。有研究5一15代之间重构胚发育能力差异不显著(Kubota，et al，2000)。Kasinathan等(2001)采用18代细胞为供核，不影响核移植重组胚的发育潜力[4]。 2.3 供核细胞的细胞周期