质粒克隆等实验_附件.docVIP

1. PCR反应 取1 μl逆转录产物为模板，在25 μl PCR扩增反应体系中先将模板于97℃变性5 min（热启动过程），加入Taq DNA 聚合酶，在PE 2400 PCR热循环仪中循环35次。 PCR反应体系： ddH2O： 15.5 μl 10(缓冲液： 2.5 μl Mgcl2: 1.5μl dNTPs(2.5 mmol/L)： 2.0 μl cDNA模板： 1.0 μl 上游引物(10 pmol/μl)： 1.0 μl 下游引物(10 pmol/μl)： 1.0 μl Taq DNA聚合酶（5 u /μl）：0.5 μl 循环参数：94℃，30s；X℃，30s；72℃，1 min；循环35次，最后一个循环在72℃延伸7 min。 2. PCR产物经琼脂糖电泳纯化和胶回收（参照胶回收试剂盒说明） 3. PCR产物直接与商品化T载体连接。 连接体系：10μl中：PCR产物 7.5μl T载体 0.5μl 10( ligase buffer 1.0