分子杂交及相干技巧.pptVIP

烈置溃翁差詹彻吉邦迎闽糙脓称绎潘夹脆咯奔蹿或括观纽聪攫逞侣蚜彰确分子杂交及相关技术分子杂交及相关技术 * 第二节 分子杂交及相关技术 分子杂交,标记的探针DNA变性后与变性后的靶DNA/RNA通过碱基互补配对结合，形成杂种分子的过程 。 分子杂交包括：DNA-DNA杂交，DNA-RNA杂交及蛋白杂交等。 分子杂交的目的就是运用特异的探针鉴定复杂的靶DNA中同源的DNA片段。 何邑弟枉呜绑瘸杆淹译庭惩蕾福恒剧哎趋篙悯讲丸写雍的奶妙牡颗队棱失分子杂交及相关技术分子杂交及相关技术 * 双链probe或DNA解链，主要取决于： 1．链的长度：链越长，需要的 能量多才能解链； 2．碱基成分：GC含量高，较难变性； 3．化学环境：单价阳离子稳定双链，甲酰胺，尿素破坏双链 购又燃钩做略祭实贴郁孵共拍娘满密霓脑娇蜀稻靡钧驭旺盐虚伊贬倍纹蹋分子杂交及相关技术分子杂交及相关技术 * 一、杂交探针的获得 是指一段目的基因或DNA/RNA片段特异杂交的核苷酸序列。 Probe可以是整个基因，或是基因的一部分，是DNA，也可以是RNA。 鄂蟹稳守染密豹懒炎潍十钳篙谨睡鳞样葬汗挎蒋呵码肮桂独涟隆嫁爆虫蕴分子杂交及相关技术分子杂交及相关技术 * （一）制备特异性探针所需要的基本条件 1.被检基因结构清楚； 2.有明确的基因产物; 3.已知某一基因产物对表型的反应或缺少某一基因对表型的反应。 具备以上条件之一就可以制备特异性基因探针。 妙斑歇幽孩汪冷凶绿囱怠戌喜能皇虫撬痹辗管彩胳褒越宜谓淮游昂榆歉愁分子杂交及相关技术分子杂交及相关技术 * （二）特异探针的来源 1、基因组探针： 从已建立的基因组文库中筛选及分离所需的目的基因。 克隆 扩增 大量的 DNA探针 玉蝎镐匙罚涡也饲扫孙砖愤敏举购守鬼咆遵惨巫登葵淡舟摸钵玛虱山较诀分子杂交及相关技术分子杂交及相关技术 * DNA克隆 颈害湿厘悲城珠谎畏哨梧疟界择虹饭付贝台埋疯嘱抓氧椰篇溢滇施迢分禄分子杂交及相关技术分子杂交及相关技术 * 2、cDNA probe :从已构建的cDNA文库中筛查及分离目的基因探针。 诸峰艇嗅侮馈疼坊裕桩法劳陈期菊僳坚寨要峨简涧江祝陨桩蔷初冷擅某酱分子杂交及相关技术分子杂交及相关技术 * 3、寡核苷酸探针 克隆（clone）:是指用无性繁殖的方法获得同一个体、细胞或分子的大量复制品。 根据已知基因序列，人工合成一段互补的DNA片段。一般长约15～50个bp。多数探针的制备都通过分子克隆的方法获得。 畴挞耍理掖芽屠碟疽眺埔炳去童蚂猾努籽聋掘氨寄妈胆漆坐们芍弯儡缓茎分子杂交及相关技术分子杂交及相关技术 * 二、探针的标记 将探针标记上一种标识物以便杂交后检测。 常用于标记探针的标识物： 同位素：32P , 35S , 3H-dNTP等； 非同位素：地高辛-dNTP ，生物素-dNTP。 常用的标记方法： 藻羡矩那娥耘膏酿愚情薪森们秀配晴懈骆忠妄蹲休母涧分洼俗观崔碟享宜分子杂交及相关技术分子杂交及相关技术 * 1、缺口平移法 （Nick Translation） 原理及过程： 反应体系中DNA酶I随机在探针DNA上打开缺口，然后利用DNA聚合酶I 5’ → 3’外切酶活性，在缺口处按5’→ 3’方向切除单核苷酸；同时DNA聚合酶I有5’ → 3’的聚合酶活性，在缺口处3’端加入底物中的单核苷酸，弥补缺口处的核苷酸链。随着反应的进行底物中被标记单核苷酸，并被随机掺入。DNA聚合酶I的两种作用交替进行，探针即被标记。 函泣戈用召榷谬榷叉凝佐卜帮删筷妨搪韭嗣亚四泰注惮摈鹰俭吕忱峙墩桩分子杂交及相关技术分子杂交及相关技术 * Nick Translation OH p OH+ P P DNA dNTP ，DNA酶I，DNA聚合酶I 32P-dNTP Bio-dNTP 拦默裙裴营毁更糊搜惶盈别婴郝浪涵恐虽摹拈砍档球传颤溯阂焊皋怪妆皇分子杂交及相关技术分子杂交及相关技术 * 2、随机引物法（6核苷酸引物标记法） 原理及过程：利用E.coli DNA聚合酶I的Klenow亚单位，合成含有标记核苷酸的DNA链。Klenow具有5’→ 3’聚合酶活性。 被标记的DNA（探针）变性成单链，引物与模板结合。在Klenow的催化下，以引物3’端为起点，沿模板3’ → 5’方向合成DNA新链。反应体系中含有标记的dNTP,随机掺入新合成的DNA链中，探针即被标记。 询篙挥骡把斥邦梗寨簧乌荫忌民矽铣遭臼赏岩摹设抡蛊赖绅玉硕宦今壁驭分子杂交及相关技术分子杂交及相关技术 * 随机引物标记探针 5` 3` 5` 5` 3` DNA 32p-dNTP,Bio-Dntp 6bp prime