分子杂交技巧.pptVIP

分子杂交技术 分子生物学中用于检测生物样本中是否含有特定的生物分子的一门技术。 三、 杂交样品膜的制备 3. 各种杂交样品膜的制备 1）原位杂交样品膜的制备 i. 原位菌落杂交样品膜 四. 标记探针的制备 切口移位法 （Nick Translation） 原理及过程： 反应体系中DNA酶I随机在探针DNA上打开缺口，然后利用DNA聚合酶I 5’ → 3’外切酶活性，在缺口处按5’→ 3’方向切除单核苷酸；同时DNA聚合酶I有5’ → 3’的聚合酶活性，在缺口处3’端加入底物中的单核苷酸，弥补缺口处的核苷酸链。随着反应的进行底物中被标记单核苷酸，并被随机掺入。DNA聚合酶I的两种作用交替进行，探针即被标记。 Nick Translation 随机引物法（6核苷酸引物标记法） 原理及过程：利用E.coli DNA聚合酶I的Klenow亚单位，合成含有标记核苷酸的DNA链。Klenow具有5’→ 3’聚合酶活性。 被标记的DNA（探针）变性成单链，引物与模板结合。在Klenow的催化下，以引物3’端为起点，沿模板3’ → 5’方向合成DNA新链。反应体系中含有标记的dNTP,随机掺入新合成的DNA链中，探针即被标记。 随机引物标记探针 六、核酸分子杂交实验因素的优化 探针的选择 在大多数情况下，可以选择克隆的DNA或cDNA双链探针 在检测单链靶序列时应选用与其互补的DNA单链探针或RNA探针 长的双链DNA探针特异性较强，适宜检测复杂的靶核苷酸序列和病原体，但不适宜于组织原位杂交 六、核酸分子杂交实验因素的优化 探针的标记方法 选择什么标记方法主要视个人的习惯和可利用条件而定； 但还应考虑实验的要求，如灵敏度和显示方法等 一般认为放射性探针比非放射性探针的灵敏度高 在对灵敏要求不高时，可采用保存时间长的生物素探针技术和比较稳定的碱性磷酸酶显示系统 六、核酸分子杂交实验因素的优化 探针的浓度 总的来说，随探针浓度增加，杂交率也增加 在较窄的范围内，随探针浓度增加，敏感性增加 膜杂交中32P标记探针与非放射性标记探针的用量分别为5～10ng/ml和25～1000ng/ml，而原位杂交中，无论应用何种标记探针，其用量均为0.5～5.0μg/ml 受不同类型标记物的固相支持物的非特异结合特性的影响 六、核酸分子杂交实验因素的优化 杂交率 现代杂交实验无论在液相杂交还是固相杂交均在探针过剩的条件下进行 在探针过量的条件下，杂交率主要依赖于探针长度（复杂度）和探针浓度。下面列出的公式适用于过剩单链探针对靶序列杂交的情形 t1/2=ln2/kc t1/2半数探针与固定靶序列杂交所需的时间（s） k =形成杂交体的速率常数[mol/(Lxntxs)]决定于探针长度（L）、探针复杂度（N）、温度、离子强度、粘度和pH c =溶液中的探针浓度（mol/L） 六、核酸分子杂交实验因素的优化 杂交最适温度 ——杂交技术最重要的因素之一 反应温度低于Tm 10～15℃，碱基顺序高度同源的互补链可形成稳定的双链，错配对减少。若反应温度再低（Tm-30℃），虽然互补链之间也可形成稳定的双链，但互补碱基配对减少，错配对增多、氢键结合的更弱 最适复性温度（Optimunm renaturation temperature, TOR）：Tor =Tm –25℃ 　　苛刻复性温度：Ts = Tm – (10或15℃) 　　非苛刻复性温度：Tns =Tm – (30或35℃) 可以通过使用高浓度盐溶液（如6.2mol/l NaCl），或使用某些有机溶剂的水溶液降低反应温度 现在认为，适当选择甲酰胺和盐水浓度及合适的反应温度，可使DNA复性和DNA-RNA杂交获得高特异性和更快的反应速度。 六、核酸分子杂交实验因素的优化 杂交的严格性 影响杂交体稳定性的因素决定着杂交条件的严格性。一般认为在低于杂交体Tm值25℃时杂交最佳 通过调节　盐浓度、甲酰胺浓度和杂交温度来控制所需的严格性 在实际应用中，寡核苷酸探针的最佳杂交温度必须精确确定。最方便的一种方法是制备一张含不同稀释度靶DNA和非特异靶DNA（如鱼精或大肠杆菌DNA）的膜。在不同温度下使膜与探针杂交，特异靶序列结合探针信号很强，而非特异靶序列与探针无任何反应的温度就是最适温度 六、核酸分子杂交实验因素的优化 杂交反应时间 在条件都得到满足的情况下，杂交的成败就取决于保温时间 一般杂交反应要进行20h左右 推荐用Cot =值来计算杂交反应时间 Cot 值实际上是杂交液中单链起始浓度（Co）和反应时