HCMVwho和国际标准.ppt

关于评估首个针对人巨细胞病毒（HCMV）的以核酸扩增（NAT）为基础的世界卫生组织国际标准的协作研究 Collaborative Study to Evaluate the Proposed 1st WHO International Standard for Human Cytomegalovirus (HCMV) for Nucleic Acid Amplification (NAT)-Based Assays 余莉 研究目的 该协作性研究的目的是通过一系列检测HCMV 的NAT试验来确定候选标准品的效力 评估候选标准品作为二级参考材料校准的合适性 以及标化HCMV的病毒载量检测。 材料----候选标准品的制备 该候选标准品是由原型的临床HCMV株----Merlin株组成的无细胞游离活病毒制剂。 该低传代株拥有良好的HCMV的特征,与实验室其他株相比，近似于完整的HCMV基因组,且已完全测序(Gene bank登录号：AY446894)。 Merlin株为gB1基因型。 考虑到用于HCMV检测样本来源的多样性，候选标准品被溶于通用的缓冲液,该缓冲液含有10mM的Tris-HCl 和人血清白蛋白,然后运用正确的样本基质来进一步稀释。最后该制剂经过冷冻干燥以确保长期稳定。 材料----批量样本的制备 HCMV Merlin毒株的组织上清样本(P4) 在MRC-5细胞内增殖，收获传至第六代的组织上清液，培养液先低速离心然后超速离心收获病毒沉淀。病毒沉淀溶于200毫升的含10mM 的Tris-HCl缓冲液(pH 7.4),包含0.5%的人类血清白蛋白(Tris-HSA缓冲液)中以制成储存病毒液。 用于候选标准品和其他样本的人类血清白蛋白为具有生产许可的产品,并经过筛选确保抗-HIV-1,HBsAg,和丙肝病毒RNA均为阴性。 制备好的批量样本最终容积为6.4 LTris-HSA的缓冲液， HCMV约为1×107拷贝/毫升,再使用磁力混合搅拌器搅拌30分钟。 取250毫升的批量液体样本分装于2毫升的Sarstedt螺钉帽管内，每等份1毫升，然后存储在-80°C。 剩下的大部分立即处理成冷冻干燥，是为了准备最终产品,NIBSC代码09/162。 材料----候选标准品的填充和冷冻干燥 进行填充金属和塑料的GmbH(Radolfzell、德国)负压隔离器 冷冻干燥机(CS150 12m2, Serail, Arguenteil, France), Bausch Strobel (Ilfshofen,德国)灌装机FVF5060 材料----充填后测试 取十二瓶冻干产品评估其剩余水分和氧含量,作为封闭后瓶完整性的指标。 剩余水分是由非侵入性的近红外(NIR)光谱(MCT 600P, Process Sensors, Corby, UK)而定的。 氧含量测量使用灯塔红外线分析仪(FMS-750,Lighthouse Instruments, Charlottesville, USA)。 为了在协作研究前确定样本的均质性，取批量液体样本(n = 18)和冻干样本(n = 18)用HCMV rea-time PCR进行测试。 材料----冷冻干燥候选样本的稳定性 冷冻干燥的小瓶将温度保持在-70°C,-20°C,+ 4°C,+ 20°C + 37°C + 45°C。 从存储的各个温度中取三瓶进行HCMV DNA real-time PCR (如前所述)。 有限的评估重构产品的稳定性。重构产品储存在+ 4°C,+ 20°C + 37°C, HCMV DNA real-time PCR在之后的24和48小时进行。 材料----研究样本的设置 样品1---- 冻干的09/162制品， 装于5 mL螺帽玻璃小瓶。 样品2---- 1毫升冷冻的HCMV Merlin株制品(用于制备冻干的候选样本)，装于2毫升的Sarstedt螺帽管。 样品3----1毫升冷冻的HCMV AD169全病毒液体，装于2毫升的Sarstedt螺帽管。 样品4 ----50μL冷冻的纯化BAC-克隆Merlin DNA，装于0.5毫升的Sarstedt螺帽管。 研究设计 合作研究的目的是为评估候选的HCMV国际标准在一系列基础NAT试验中的适用性和效能。 四瓶研究样本1 - 4通过快递公司的干冰运输到参与的实验室,按照特定的说明书来存储和重建。 研究协议 要求参与者在四个不同的场合使用他们常规的基础NAT检测HCMV，检验每个稀释的样本,在分开的独立的实验中使用新的样本瓶。 将冻干样品1用1毫升去离子,无核酸酶的水重建，在使用之前至少搅拌20分钟。研究样品1 - 3在使用前已被解冻,震荡混匀。 要求参与者在定量分析的范围内用各自分析中所用的样本基质来稀释样品