DNA分析芯片及新一代测序技术在染色体病诊断中的应用 2013产前筛查和产前诊断培训班课件.ppt

母体血浆中的胚胎DNA Fetal cf-DNA detected via Y chromosome Lo YM et al., Lancet 1997 胎儿游离DNA：cell-free fetal DNA（cffDNA） 母体外周血含有cffDNA，几乎全部来源于胎盘滋养细胞。 怀孕4周可检出，8周后含量上升并稳定存在。（7周建立胎儿胎盘循环） cffDNA片段比较小，长度在75bp和250bp之间。 母体外周血中的cffDNA含量在5%到30%之间。孕周越大外周血中胚胎DNA的含量越高。 产后2hr之内消失。 血浆 20% 胚胎 DNA 10 11 染色体异倍体导致剂量变化 检测计量变化对精度的要求 纯胚胎DNA，唐氏与正常21号染色体的剂量变化： 3 : 2 = 1.5 血浆DNA中胚胎DNA占20%时，唐氏与正常21号染色体的剂量变化： 11 : 10 = 1.1 母体血浆DNA中胚胎的DNA一般占5%到30%，大多小于20% 唐氏与正常21号染色体的剂量变化大多 1.1 当胚胎DNA只占5%时，怀唐氏胚胎的母体血浆DNA的21号染色体量理论上会增加2.5% 荧光定量PCR（realtime PCR）的精确度（CV）在42% 数码PCR（digital PCR)的精确度（CV）在15% 第二代测序的精确度（CV）在0.5%以下 新一代测序技术检测胚胎染色体拷贝数变化 采集母体血浆 提取血浆DNA 制备测序文库 在第二代测序仪上测序 测得的序列与人的参考基因组比对并作统计分析 临床研究结论 *T13假阳性为45X样本。 对5大染色体的非整倍体检出率100%，复合假阳性率0.3%。 国际临床试验总结 研究单位 香港中文大学 Sequenom公司 Verinata公司 香港中文大学 Sequenom公司 Aria公司 Sequenom公司 发表时间 2011.1 2011.3 2011.4 2011.7 2011.11 2012.1.23 2012.2.2 发表杂志 BMJ AJOG Clin Chem PlosOne Genet. Med AJOG Genetics in Medicine 样品量 314 449 119 392 1696 400 HiSeq2000 血浆量（ml） 4 4 ~5 2-4.8 4 2 HiSeq2000 样品混合度 2-plex 4-plex 1-plex 2-plex 4-plex N/A 4-plex 所用仪器 GAⅡx GAⅡx GAⅡx GAⅡx HiSeq2000 HiSeq2000 HiSeq2000 所用技术 标准流程 标准流程加质控 标准流程加新算法 标准流程 标准流程加质控 基于SNP的DANSR技术 标准流程加新算法 检测的染色体 T21 T21 T21/T18 T13/T18 T21 T21/T18 T13/T18 灵敏度 100% 100% 100% T13:100% T18: 92% 98.6% T21:100% T18: 98% T18:100% T13: 91.7% 准确度 97.90% 99.70% 100% T13:98.9% T18:98% 99.80% T21:100% T18:98% T18:100% T13:99.1% CV控制 无创产前检测的国际现状 美国 现有四家公司进入：Sequenom, Ariosa, Verinata, Natera 两家正式提供业务：Sequenom和Ariosa 检测模式：医院提供血样-〉公司检测及出报告-〉医院 二级筛查(confirmatory test) 普遍认为将来为近诊断级的筛查技术(nearly diagnosis) 欧洲 目前只有德国一家公司：LifeCodexx 与美国的Sequenom合作，采用Sequenom技术 其他地区 香港：CUHK，目前送检Sequenom，即将香港本地化 临床实践数据总表 采血时间跨度 2012.1.1-2012.10.25 总样本数： 26453 平均孕周： 18.96179周 孕妇平均年龄： 31.5034岁 总阳性样本数 492，1.86% 总阴性样本数 25961，98.14% 总高龄样本数（≥35） 9003，34.03% 总低龄样本数（35） 17304，65.41% 有唐筛记录的样本数 9919 唐筛高风险（≥1/270)样本数 8090，81.56% 唐筛临界风险（1/270X≤1/1000） 1465，14.77% 唐筛低风险（1/1000） 364，3.67% 时间 总样本数 T21 T18 T13 性染色体异常 综合阳性率 2012年1月至10月25日 26453 269 76 21 106 1.78% 总结： 1.