病毒分离鉴定技术.doc

猪繁殖与呼吸综合征 (Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的猪的一种繁殖障碍与呼吸困难的传染病。其特征为发病母猪厌食、发热，怀孕后期发生流产、死胎和木乃伊胎，幼龄仔猪发生呼吸道症状[1]。1987年在美国中西部首先发现该病，并分离到病毒，其后在北美、欧洲、亚洲等国家流行。目前该病已在全球范围内传播、蔓延。我国郭宝清等[4]于1996年首次从暴发流产的胎儿中分离到PRRSV。国内诸多血清学检测结果表明，该病在我国许多地方已有流行[5]。河南某猪场"猪场发生临床症状疑似PRRS的传染病，用间接ELISA法检测，呈PRRS抗体阳性。从病猪肺、淋巴结病料中分离到1株疑似PRRSV，并对其进行了一系列的鉴定。? 1　材料与方法? 1.1　材料? 1.1.1　病料　采自河南某猪场疑似 PRRS发病仔猪肺脏及淋巴结。? 1.1.2　细胞及血清　细胞系Marc­145、Vero、PK­15均购自中国兽药监察所；阳性血清购自中国兽药监察所；阴性血清采自无PRRS病史猪场的新生仔猪血清，经中和试验证明为阴性。? 1.1.3　主要试剂及试剂盒　RNasin、dNTP、反转录? ?Buffer、M­MLV、rTaq酶均购自宝生物(大连)工程有限公司；琼脂糖为? Sigma公司产品；其他常规试剂均为分析纯；UNIQ­10柱式Trizol总RNA抽提纯化试剂盒购自上海生工生物工程技术服务有限公司。? 1.1.4　RT­PCR引物设计　根据GenBank公布的 PRRSV美洲株ORF5核苷酸序列，参照文献[6]自行设计并由宝生物(大连)工程有限公司合成下述一对引物，引物扩增片段长度为 720bp；上游引物 P1 5′­CTG GAG CCG TGC TAT CAT­3′；下游引物 P2 5′­TCC ATT? TCA TGA CAC CTG­3′。? 1.2　方法? 1.2.1　细胞培养　生长液为含 100 mL/L新生牛血清(NCS)的 RPMI­l640培养液；维持液为含 20 mL/L NCS的 RPMI­l640培养液。Marc­145、Vero和PK­15细胞均在体积分数为5%的CO2培养箱中于37 ℃培养至单层后传代培养。? 1.2.2　病料的处理　无菌采集发病仔猪的淋巴结、肺脏、脾脏等组织并剪碎，用 Hanks液研磨并制成5倍～10倍的乳悬液，反复冻融 3次后，经5 000 r/min离心 30 min，上清悬液用 0.22μm微孔滤膜过滤后，－20 ℃保存备用。? 1.2.3　病毒的分离　将上述处理的病料悬液 1 mL分别接种于长成单层的? Marc­145细胞、Vero细胞和PK­15细胞，37 ℃吸附 1 h，补加维持液至 8 mL，继续培养 3 d～5 d，反复冻融 3次，收获培养上清液，同时设参考毒株、正常细胞作为对照。出现典型PRRSV细胞病变时按上述方法继续传代，供进一步检测备用，连传5代未出现 CPE者判为阴性。? 1.2.4　分离毒的毒价滴定(TCID50)　采用微量法按参照文献[7]进行，测定其在Marc­145上的?? TCID50，结果按 Reed­Muench氏法计算。? 1.2.5　病毒中和试验　采用固定病毒­稀释血清法，按参照文献[7]进行，并按 Reed­Muench氏法计算中和指数。? 1.2.6　分离毒的动物回归试验　将 107.5TCID50/mL HN株病毒细胞培养液经口鼻途径接种 30日龄健康猪2头，3.0 mL/头，并设1头健康猪接种正常细胞培养物作为阴性对照，隔离饲养，每日测体温，并观察其采食、饮水、精神状况及其他临床表现，1周左右剖检观察其病变。然后分别采集接种猪和阴性猪的肺脏、淋巴结等组织，用作PCR检测。? 1.2.7　RT­PCR鉴定? 1.2.7.1　病毒基因组总 RNA的提取　按总 RNA抽提纯化试剂盒说明提取。? 1.2.7.2　反转录(RT)　0.8 μL MgCl2(25 mmol/L)、4.0 μL 反转录buffer (5×)、2 μL：dNTP (10 mmol/L)、1.0 μL P1 (25 pmol/L)、1.0 μL P2? (2 5 pmol/L)、1.0 μL RNasin(40 U/μL)、9.2 μL 总 RNA，然后置于 PCR仪上 65 ℃? 15 min后，加入 M­MLV(5 U/μL)? 1.0 μL，最后 于42 ℃ 1 h，95