血管内皮生长因子vegf实时荧光定量pcr质粒标准-云南农业大学.pdfVIP

云南农业大学学报　ＪｏｕｒｎａｌｏｆＹｕｎｎａｎＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，２０１１，２６（３）：３２８－３３３ ｈｔｔｐ：／／ｘｂｙｎａｕｅｄｕｃｎ ＩＳＳＮ１００４－３９０Ｘ；ＣＯＤＥＮＹＮＤＸＡＸ Ｅｍａｉｌ：ｘｂ＠ｙｎａｕｅｄｕｃｎ ＤＯＩ：１０３９６９／ｊｉｓｓｎ１００４－３９０Ｘ（ｎ）２０１１０３００８ 血管内皮生长因子（ＶＥＧＦ）实时荧光定量 ＰＣＲ质粒标准品的构建 １ ２ ３ １ ２ ２ 刘丽仙 ，霍金龙 ，李　颖 ，赵　跃 ，霍海龙 ，曾养志 （１云南农业职业技术学院畜牧兽医系，云南 昆明６５０２１２； ２云南农业大学，云南省版纳微型猪近交系重点实验室，云南 昆明６５０２０１； ３昆明医学院第二附属医院整形外科，云南 昆明６５０１０１） 摘要：应用ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ荧光染料检测方法构建 ＶＥＧＦ基因质粒标准品，能快速、灵敏、可靠的检测与临床多 种疾病密切相关的重要候选基因血管内皮生长因子 （ＶＥＧＦ）的表达情况。本研究利用版纳微型猪近交系４～ ６月龄猪，提取皮肤创面总ＲＮＡ，设计特异引物，进行ＲＴＰＣＲ扩增。纯化目的片段并与ｐＭＤ１８Ｔ载体连接， 转化宿主菌ＤＨ５，提取重组质粒ＤＮＡ，并经酶切、ＰＣＲ和测序鉴定，计算重组质粒原液拷贝数浓度并制备 α 梯度浓度标准品，进行实时荧光定量ＰＣＲ。建立的ＶＥＧＦ基因ｍＲＮＡ表达实时荧光定量ＰＣＲ检测方法特异性 ３ ３ ８ 较好，检测灵敏度可达１０×１０拷贝，线性范围达１０×１０～１０×１０拷贝，阈值循环数 （Ｃｔ）与ＰＣＲ体系 ２ 中起始模板量的对数值之间存在良好的线性关系 （ｒ＝０９８２），扩增效率高 （Ｅ＝９６９２％）。通过构建版纳微 型猪近交系ＶＥＧＦ基因质粒标准品，为探讨 ＶＥＧＦ基因在临床多种疾病中所发挥的分子机理奠定基础。 关键词：实时荧光定量；ＶＥＧＦ基因；质粒标准品 中图分类号：Ｓ８２８９１　　文献标识码：Ａ　　文章编号：１００４－３９０Ｘ（２０１１）０３－０３２８－０６ ＣｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆＳｔａｎｄａｒｄＰｌａｓｍｉｄｆｏｒＤｅｔｅｃｔｉｎｇｔｈｅＶａｓｃｕｌａｒ ＥｎｄｏｔｈｅｌｉａｌＧｒｏｗｔｈＦａｃｔｏｒＧｅｎｅ（ＶＥＧＦ）ｂｙＵｓｉｎｇ ＲｅａｌｔｉｍｅＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅＱｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＰＣＲ １ ２ ３ １ ２ ２ ＬＩＵＬｉｘｉａｎ，ＨＵＯＪｉｎｌｏｎｇ，ＬＩＹｉｎｇ，ＺＨＡＯＹｕｅ，ＨＵＯＨａｉｌｏｎｇ，ＺＥＮＧＹａｎｇｚｈｉ （１．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＨｕｓｂａｎｄｒｙａｎｄＶｅｔｅｒｉｎａｒｙ，ＹｕｎｎａｎＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＶｏｃａｔｉｏｎａｌＴｅｃｈｎｉｃａｌＣｏｌｌｅｇｅ，Ｋｕｎｍｉｎｇ６５０２１２，Ｃｈｉｎａ； ２．ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＢａｎｎａＭｉｎｉｐｉｇＩｎｂｒｅｄＬｉｎｅｏｆＹｕｎｎａｎＰｒｏｖｉｎｃｅ，ＹｕｎｎａｎＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｋｕｎｍｉｎｇ６５０２０１，Ｃｈｉｎａ； ３．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＰｌａｓｔｉｃＳｕｒｇｅｒｙ，ｔｈｅＳｅｃｏｎｄＡｆｆｉｌｉａｔｅｄＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＫｕｎｍｉｎｇＭｅｄｉｃａｌＣｏｌｌｅｇｅ，Ｋｕｎｍｉｎｇ６５０１０１，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＴｈｅｐｕｒｐｏｓｅｏｆｔｈｉｓｓｔｕｄｙｔｏｂｕｉｌｄａｓｔａｎｄａｒｄｐｌａｓｍｉｄｏｆｔｈｅＶＥＧＦｇｅｎｅｗｈｏｓｅｆｕｎｃｔｉｏｎｗａｓ ｃｌｏｓｅｌｙａｓｓｏｃｉａｔｅ