分类号-科学网.doc

目 录 摘 要 I Abstract II 第一部分：前言 第一章 文献综述 1 1.1.我国花生发展现状 1 1.2. 黄曲霉毒素对我国花生产业发展的影响 1 1.3 .花生黄曲霉抗性品种的研究进展 2 1.3.1固有抗性：果荚、种皮结构 2 1.3.2固有抗性：种子的抗菌成分 3 1.3.3 诱导抗性的研究 4 1.4黄曲霉抗性的研究难点 6 1.4.1黄曲霉抗性的复杂性 6 1.4.2黄曲霉抗性与其他抗性的联系 6 1.5本研究的背景、内容和意义 6 1.5.1研究背景 7 1.5.2研究内容 10 1.5.3研究意义 11 第二部分：材料与方法 第二章 相关基因的克隆与测序 13 2.1 引言 13 2.2 仪器、试剂与材料 13 2.2.1 仪器、试剂 13 2.2.1.2 主要试剂 14 2.2.1.3 常用缓冲液、试剂的成分及配制方法 14 2.2.2 材料 15 2.3 实验技术路线 15 2.3.1 基因的3端克隆 15 2.3.2 基因的5端克隆 16 2.4 实验方法（3端克隆） 17 2.4.1 提取RNA用品的除RNA酶处理 18 2.4.2 CTAB法提取发育中的抗性花生种皮的RNA 18 2.4.3 反转录cDNA第一链的合成 18 2.4.4 目的片段的PCR扩增 19 2.4.5 目的片段的回收 20 2.4.6 目的片段与载体的连接 20 2.4.7 氯化钙法制备感受态细胞及转化 20 2.4.8 碱裂解法小量制备质粒DNA 20 2.4.9 PCR法鉴定阳性克隆 20 2.5 实验方法（5端克隆） 21 2.5.1 提取RNA用品的除RNA酶处理 21 2.5.2 CTAB法提取发育中的抗性花生种皮的RNA 21 2.5.3去磷酸反应 21 2.5.4.TAP反应 22 2.5.5接头连接反应 22 2.5.6接头的准备 23 2.5.7 反转录全长cDNA第一链的合成 23 2.5.8 全长cDNA的富集 23 2.5.9 目的片段的PCR扩增 24 2.5.10 目的片段的回收与测序 25 第三章 黄曲霉抗性相关基因的表达分析 26 3.1 引言 26 3.2 材料和方法 26 3.2.1 仪器、试剂 26 3.2.2 材料 26 3.3 实验技术路线 27 3.4 实验方法 27 3.4.1 提取RNA用品的除RNA酶处理 27 3.4.2 CTAB法提取发育中的抗性花生种皮的RNA 27 3.4.3 反转录cDNA第一链的合成 27 3.4.4 实时荧光定量PCR 27 第三部分：结果与分析 第四章 结果与分析 29 4.1 引言 29 4.2 cDNA3‘端的克隆结果鉴定 29 4.2.1 CTAB法提取发育中的抗性花生种皮的RNA 29 4.2.2 3’端克隆结果的质量鉴定 30 4.3 全长cDNA的克隆 31 4.4 荧光定量PCR的结果鉴定 33 4.4.1 花生RNA的质量鉴定 33 4.4.2 cDNA的质量鉴定 34 4.4.3 实时荧光定量PCR分析 35 4.5.tubulin（AW350953，BI971077）； 36 4.5.1 基因的表达模式 36 4.5.2 blast est相似基因在不同的花生品种中的分布 40 4.6.水通道蛋白（AF047049）； 42 4.6.1 基因的表达模式 42 4.6.2 blast est相似基因在不同的花生品种中的分布 44 4.7.SRP（CD392810）； 47 4.7.1 基因的表达模式 47 4.7.2 blast est相似基因在不同的花生品种中的分布 48 4.8 类受体蛋白激酶（AY163905）； 49 4.8.1 基因的表达模式 49 4.8.2 blast est相似基因在不同的花生品种中的分布 50 4.9. 核糖体蛋白L41（CD399094）； 51 4.9.1 基因的表达模式 51 4.9.2 blast est相似基因在不同的花生品种中的分布 53 4.10. 囊泡相关膜蛋白（BF423736）； 54 4.10.1 基因的表达模式 54 4.10.2 blast est相似基因在不同的花生品种中的分布 56 4.11. SHAGGY-LIKE KINASE（BF595610）。 57 4.11.1 基因的表达模式 57 4.11.2 blast est相似基因在不同的花生品种中的分布 59 4.12 总结 59 参考文献 61 致谢 64 附录 攻读学位期间所发表的学术论文目录 65 摘 要 本研究对前期基因芯片结果揭示的8个在黄曲霉抗性品种中上调表达的基因用荧光定量PCR的方法和生物信息学分析进行验证，并且在此基础上克隆黄曲霉抗性的相关基因。通过对发育中花生不同时期的果