转人MCP和CD59双基因小鼠的制备.pdfVIP

第五届中南地区实验动物科技交流会 论文汇编 转人MCP和CD59双基因小鼠的制备+ 李莉，郑新民，魏庆信，魏雁 (湖北省农业科学院生物技术研究所，武汉430064) 【摘要】为了获得器官移植用转人MCP(膜辅因子蛋白)和CD，，(腱反应性溶解 抑制物)双基因小鼠动物模型，本研究采用显微混合注射的方法制备转人MCP和 CD。双基因小鼠，共注射478枚受精卵，移植于21只受体，其中14只受孕，8只受孕小 鼠中连流产，从6只受孕小鼠获得18只仔鼠，经检测，其中9只仔鼠单基因阳性 (50％)，6只仔鼠双基因阳性(33．3％)。结果表明：通过显微混合注射的方法可以获 得转人MCP和CD。双基因小鼠。 【关键词】小鼠、MCP、CD。显微注射、转双基因 随着外科手术的不断成熟，免疫抑制剂的不断发展，器官移植成功率的大大提高，从而出现了供 体严重短缺现象，众多医生希望通过基因工程技术使异种器官移植获得成功，要使异种器官移植这 一颇具想象力和刺激性的工作应用于临床，亟待解决的问题是克服急性超排斥反应(HAR)”1，而” 超级小鼠”【23问世。将外源基因导人小鼠胚胎并建立转基因小鼠技术，已成为探索生物发育、细胞分 化、遗传疾病基因表达调控等重要生命现象奥秘的分子生物学技术，并广泛用于建立动物模型，使转 基因技术成为研究热点。近几年，MCP，DAF和CD，，已成为研究方向，以其为主的细胞膜表面分子的 基因转入动物体内，替代不能有效调节人补体作用的动物自身的补体调节蛋白(CRP。)．在不同环节 抑制膜表面攻击复台体的形成，来保护血管内皮细胞，防止细胞裂解，对HAR有一定的抑制作用。 有关在细胞水平的报道，联合表达两种或三种补体调节蛋白效果更佳”01．但联合转这些基因的动物 未见报道。因此，本文将通过显微混合注射MCP和CD。基因的方法建立器官移植用转双基因小鼠 模型，为异种器官移植提供技术平台。 1材料与方法 1．1主要试荆及仪器 孕马血清促性腺激素(PMSC，天津市华孚高新生物技术公司)；人绒毛膜促性腺激素(HCG，南京 动物激素厂)；玻璃酸酶(上海生物制品厂)；戊巴比妥钠；M2目M，。(自配”1)；熔断仪；拉针仪；立体 显微镜；毛细玻璃管；倒置显微镜。 1．2供体鼠与受体鼠的超排 实验动物为昆明小白鼠，由湖北省医学科学院实验动物中心提供。259以上的母鼠，尾静脉注射 5—10IU PMSG，注射后46—48h注射5—10IUHCG进行超排”。’。注射HCG的当天，供体鼠与种公 ·本课题受国家”863”项日2001AA216071支持 作者简介：李莉女1972年生，研究实习员。 544 论文汇编 第五届中南地区宾验动物科技交流会 鼠合笼，受体鼠与结扎公鼠合笼，第二天上午检查阴栓，选取有阴栓的母鼠分别为供体鼠和受体鼠。 1．3受精卵的获取 将供体鼠脱颈处死，在无菌操作下迅速取出输卵管置于200ulM：培养液中，在实体显微镜下刺 破壶腹部或用钟表镊子轻轻压出包含受精卵的卵丘细胞团，转入含300ug／ml玻璃酸酶”1的M：液中 消化，移出已游离的受精卵于新鲜的M：中，用M：洗涤3次，然后将受精卵转人M。6培养液中，置于 培养箱中培养。 1．4受精卵的培养 受精卵置50汕的M，。培养液的液滴中，覆以石蜡油，培养条件为3712，5％CO：和饱和湿度在培 养箱中培养。选出雌雄原核清晰的受精卵待注射。 1．5外源基目的导入 ． 将武汉大学提供的人MCP和cD。基因，按拷贝数1：1混合，浓度稀释为5ug／ml，待注射。一般 在获取受精卵的当天下午1：30到4：00问注射，此时受精卵雌雄原核最清晰。将吸有基因的注射针 快速刺人雄原核口1中，注射2pl基因，迅速退出注射针。每次注射20枚卵，培养，待移植。 1．6经显微注射的受精卵的移植 将当天的同步发情的受体母鼠．用戊巴比妥钠按100mg／kg量尾静脉麻醉。采用头左尾右的方 式放置，剪去被毛，在最后一根肋骨与脊髓旁1cm处剪开一横切口，用镊子夹住脂肪垫将卵巢．输卵 管和子宫角部分拉出，在实体显微镜下避开血管撕