荧光PCR定量技术.ppt

融解曲线的分析 理想的融解曲线应该只有单一峰型曲线。 如果出现两个或以上的峰型，说明有引物二聚体等非特异性扩增产生，需要对反应条件进行优化或重新设计引物。 优点：成本较低，无须对引物或探针进行特殊的荧光标记，操作亦比较简单 ，适合于筛检。 缺点：特异性不够，染料分子会结合到非特异性扩增产生的双链分子和引物二聚体中，使反应体系中的荧光本底较高 （SYBR Green I）标记的优、缺点 实时荧光PCR的理论基础 荧光共振能量转移（FRET）：当一个荧光基团与一个荧光淬灭基团（可以淬灭前者的发射光谱）的距离邻近至一定范围时，就会发生荧光能量转移，淬灭基因会吸收荧光基团在激发光作用下的激发荧光，从而使其发不出荧光。但如果荧光基团一旦与淬灭基团分开，淬灭作用即会消失。所以，利用核酸杂交和核酸水解所致荧光基团和淬灭基团结合或分开的原理，建立各种实时荧光PCR。 TaqMan Probe法 TaqMan Probe法是使用5’端带有荧光物质（如：FAM等），3’端带有淬灭物质（如：TAMRA等）的TaqMan探针进行荧光检测的方法。当探针完整时，5’端的荧光物质受到3’端的淬灭物质的制约，不能检出荧光。而当TaqMan探针被分解后，5’端的荧光物质便会游离出来，发出荧光。 当PCR反应液中加入荧光探针后，在PCR反应的退火过程中，荧光探针便会和模板杂交，进一步在PCR反应的延伸过程中，DNA聚合酶的5’→3’核酸外切酶活性可以分解与模板杂交的荧光探针，游离荧光物质发出荧光，通过检测反应体系中的荧光强度，可以达到检测PCR产物扩增量的目的，具体原理如下图： TaqMan Probe法原理 TaqMan探针 水解型 1.荧光素，淬灭剂 2.FRET（荧光共振能量传递） 3.识别特异性产物 优点 对目标序列特异性高 缺点 1.只适用于一个目标（特异序列） 2.价格较高（1000-2000元） 3.探针5‘端不能是G（切下后淬灭） 荧光化学监测方式总结 化学试剂 工作原理 有否淬灭剂 主要应用范围 SYBR Green I 结合于双链DNA的小沟中 否 熔解曲线分析 定量和检测目标基因 TaqMan 水解型杂交探针（5‘-3’外切） 有 SNP分析 定量和检测目标基因 TaqMan MGB 探针法原理 在TaqMan探针的基础上，进一步发展了MGB探针。在它的3‘端连接的不是通常的TAMRA淬灭基团，而是一种非荧光淬灭剂（NFQ），其3’还有一种小沟结合分子，即MGB探针，该分子折叠进入dsDNA小沟，从而使探针和模板紧紧结合。 MGB探针在检测SNP和定量分析甲基化等位基因方面具有优势。 TaqMan MGB 探针法 TaqMan MGB 探针能分辨一个碱基的差别 TaqMan MGB 探针法原理图示 实时荧光定量PCR技术 一、荧光定量 PCR仪 荧光定量PCR仪是一种带有激发光源和荧光信号检测系统的PCR仪，通常配有电脑系统及相应的分析软件。 实时在线监控 能够实时地观察到产物的增加,直观地看到反应的对数期 降低反应的非特异性 使用引物和荧光探针同时与模板特异性结合,提高了PCR反应的特异性 增加定量的精确性 全程监控,准确的算法进行定量 减少污染 采用闭管检测，不需PCR后处理，并采用dUTP-UNG酶的防污染系统，扩增和检测一次同时完成，避免假阳性。 结果分析更加快捷方便,无需跑胶 光谱分析仪直读结果，自动分析， 增强了灵敏性和客观性。 与普通PCR的区别（二） 实时荧光定量 PCR（real-time PCR) 应用方法：通过荧光染料或荧光标记的特异性探针,对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控扩增反应中每一个循环产物荧光信号，结合相应的软件对结果进行分析，从而实现对起始模板定量及定性分析。 荧光实时定量PCR定量原理 PCR每进行1个循环，DNA呈2倍的指数关系增长，不久达到平台期。起始DNA量越多扩增产物量便越早达到检出值，也就是扩增曲线越早起峰。我们将已知浓度的标准品梯度稀释进行Real Time PCR，就会按照起始DNA量由多到少得顺序等间隔得到一系列扩增曲线。再由Ct值与起始模板的对数值之间存在的线性关系，就可以制作成下图标示的标准曲线。未知浓度的样品与标准品相同，检测未知样品CT值，并将其代人标准曲线，就可以求出未知浓度样品的起始模板量，这就是Real Time PCR的定量原理。 在实时荧光定量 PCR 反应中，引入了一种荧光化学物质，随着 PCR 反应的进行， PCR 反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线?????????????????????????