吉大生化实验课件.ppt

啤酒酵母蔗糖酶提取、分离纯化、性质鉴定及反应动力学实验 一、目的要求 1、熟悉工作曲线的制作方法及使用注意事项； 2、学习掌握 3,5-二硝基水杨酸（DNS）比色 定糖的原理和方法； 3、学习掌握 Folin-酚法测定蛋白质含量的原 理和方法； 4、学习酶蛋白分离提纯的原理； 5、学习掌握酶的比活力测定及其计算方法； 6、运用正交试验法确定温度、pH值、离子浓度的最适条件 ； 7、学习掌握酶促反应动力学中用双倒数法测 定Km 的方法； 8、学习掌握SDS电泳原理和操作技术 （3）离子交换层析 如何选择离子交换介质 装柱：本实验使用DEAE52离子交换树脂。柱内的DEAE52离子交换树脂应非常均匀地分布，防止出现截面和气泡，床面要平整。用起始缓冲液洗柱，控制好流速（防止流干）； 平衡：用5mmol/L pH6.0的磷酸起始缓冲液平衡过夜。 上样：注意控制流速，使流出液的流出速度为1.5ml/min左右。 洗柱：样品全部进入床面后，在柱面加入2cm的缓冲液，在储液瓶中加入5mmol/L pH6.0的磷酸缓冲液，连接紫外检测器、记录仪和收集器，打开截流阀，洗出未吸附的杂蛋白。洗柱体积控制在5个柱体积左右。 洗脱：本实验用含0.15mol/L NaCl的5mmol/L pH6.0的磷酸缓冲液洗脱，控制流速为1.5ml/min，用小试管收集。 凝胶层析的基本原理 凝胶层析是利用凝胶把分子大小不同的物质分离开的一种方法，其原理是分子筛效应，混合样品如同“过筛”一样，因分子大小的不同得以彼此分开。 3.数据处理（有关计算 ） 1）[E]= 葡萄糖mg数×（4.5/0.5）×E的的稀释倍数/2ml =（ ）u/ml 2）总活力：[E]×V 3）[Pr]：查标准曲线 4）总Pr量：[Pr]×V 5）比活力：[E]/[Pr] or 总活力/总Pr量 6）阶段收率：E2活力/E1活力、E3活力/E2活力 7）总收率：E3总活力/E1总活力 8）提纯倍数：比活力n/比活力n-1，n=1，2，3 将计算出的数据添表：表格见后 变化一个因素而固定其它因素，如首先固定B、C于B1、C1，使A变化之，则： 如果得出结果A3最好，则固定A于A3，C还是C1，使B变化，则： 得出结果B2最好，则固定B于B2，A于A2，使C变化，则： 实验结果以C3最好。于是得出最佳工艺条件为A3B2C2。 A温度（℃）1 B时间（Min）2 C用碱量（x%）3 4 转化率（x%） 1 1(80℃) 1(90Min) 1(5%) 1 31 2 1(80℃) 2(120Min) 2(6%) 2 54 3 1(80℃) 3(150Min) 3(7%) 3 38 4 2(85℃) 1(90Min) 2(6%) 3 53 5 2(85℃) 2(120Min) 3(7%) 1 49 6 2(85℃) 3(150Min) 1(5%) 2 42 7 3(90℃) 1(90Min) 3(7%) 2 57 8 3(90℃) 2(120Min) 1(5%) 3 62 9 3(90℃) 3(150Min)