GFP蛋白表达基因的突变.doc

实验目的 通过对GFP蛋白表达基因的突变，使其表达性状发生变化，使其不能正常表达出产生绿色荧光。进而熟练掌握基因定向突变的一系列流程。 实验原理 利用PCR介导的定点突变来使DNA链上碱基突变，进而控制转录翻译与GFP绿色荧光蛋白的表达，使其不能发出正常的荧光。问题的关键在于突变基因的获得，在PCR介导的定点突变中需要4种扩增引物(两对引物)，进行3次PCR反应，头两次PCR反应中，应用两个互补的并在相同部位具有相同碱基突变内侧引物（本实验为针对AAG的TT A突变），扩增形成两条有一段可彼此重叠的双链DNA片段，通过电泳来去除未掺入的多余引物之后这两条双链DNA片段经变性和退火可以形成具有3,凹末端的异源双链DNA分子。在TaqDNA聚合酶的作用下，产生含重叠序列的双链DNA分子，这样便产生了突变DNA分子。 实验流程： 1.1.DH5α（GFP）提取质粒→检测→酶切（Ecol1，BamH1）→回收（载体，GFP）→检测 1.2.GFP片段→第一轮PCR（引物1和突变引物2，引物2和突变引物1）→检验回收→第二轮PCR（前两次PCR产物混合作为模板）→回收检测→酶切→回收→电泳检测 1.3.第二轮PCR回收产物与载体连接→感受态细胞转化（BL21）→筛选：→提取质粒→鉴定 →诱导表达 1.4.PAGE电泳检测→测序 2 实验方法 2.1DH5α质粒的提取： 在60mL LB培养基中添加30μL卡拉霉素和10μL保藏的含有DH5α的E.coli的菌液，在37℃的摇床上过夜培养。 取1.5mL含有DH5α的E.coli的菌液，于Ep管中，12000prm/min,离心1min，去掉上清液，收集菌体。加100u1溶液I振荡使菌体充分悬浮，冰浴5min，加200ul新配制的溶液II轻轻摇匀冰浴10min，加150ul溶液III，摇匀冰浴5min 然后12000rpm,离心5min,将上清移入另个Ep管中。加等体积的酚:氯仿=1：1抽提一次，移出的水相中加入2倍体积的无水乙醇混匀-20℃放置15min, 12000rpm离心l5min, 沉淀用70%的乙醇洗一次，再离心，沉淀干燥后溶于20ul TE，4℃保存。 2.2酶切：酶切反应体系（25μL） DH5α质粒 10μL Buffer 2.5μL 酶1 0.6μL 酶2 0.6μL ddH2O 11.3μL 37℃过夜 2.3 定点突变 (1) AAG左侧片断的PCR扩增： PCR反应体系（25μL） 模板DNA 1μL Taq酶 0.8μL 10×Buffer 2.5μL dNTP 1μL 引物1 1μL 突变引物2 1μL ddH2O 17.7μL (2) AAG右侧片断的PCR扩增: PCR反应体系（25μL） 模板DNA 1μL Taq酶 0.8μL 10×Buffer 2.5μL dNTP 1μL 引物2 1μL 突变引物1 1μL ddH2O 17.7μL (3 )PCR反应程序： PCR反应程序 94℃预变性 5min 94℃变性 1min 50℃退火 1min 72℃延伸 1min 循环30次 72℃延伸 5min （4）电泳检测： 取1.0g琼脂糖，加100mL的0.5×TBE，加热至完全溶解（1%的琼脂糖凝胶），室温冷却至50℃左右，倒入制凝胶板中，厚度约为5~8mm。完全凝固后，放入电泳槽中，加TBE至没过凝胶2~3mm。 取2μL待检测的物质，与3μL上样缓冲液混合均匀，加入点样孔中。 打开电源，调节电压60V。待溴酚蓝跑过胶板的2/3时，停止电泳。取出凝胶，放入EB中染色15min，放在紫外灯下检测。 （5）PCR产物回收（试剂盒）：20℃保存。 (6 )含突变位点的全长基因的PCR扩增:上述的左右侧片段用试剂盒回收后互为模板，进行含有突变位点的全长基因扩增，PCR反应条件: PCR反应体系（25μL） 长片段DNA 0.5μL 短片段DNA 0.5μL Taq酶 0.5μL 10×Buffer 2.5μL dNTP 0.5μL ddH2O 19.5μL PCR反应程序 94℃预变性 5min 94℃变性 1min 50℃退火 1min 72℃延伸 1min 循环5次 72℃延伸 5min 再在PCR管内添加各0.5μL的引物1和引物2，继续PCR.PCR反应程序 94℃预变性 5min 94℃变性 1min 50℃退火 1min 72℃延伸 1min 循环25次 72℃延伸 5min 再行电泳检测，然后用试剂盒回收，回收之后再用电泳检测。 2.1.2突变体克隆载体的构建（DH5a菌用于扩增） 连接反应体系（10μL） 第三次PCR回收产物