H9亚型禽流感病毒SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR法检测方法的建立.pdf

青岛农业大学学报 (自然科学版) 30(3)：195～199，2013 JournalofQingdaoAgriculturalUniversity (NaturalScience) 文章编号 ：1674—148X(2013)03—0195一O5 H9亚型禽流感病毒 SYBRGreenI荧光定量 RT—PCR法检测方法的建立 徐守振 ，尹燕博 (青 岛农业大学动物科技学院，山东 青 岛 266109) 摘要 ：RT—PCR扩增 H9亚型禽流感病毒 (AIV(H9))的HA基 因保守片段 ，将其克隆到 pMD18一T载体 ，经测序验 证正确作为阳性质粒。以阳性质粒为标准品，建立 SYBRGreenI荧光定量 RT—PCR的标准曲线。结果表明，该方 法灵敏性可达 74．3copies／~L，且特异性好、重复性佳 。SYBRGreenI实时荧光定量 RT—PCR方法为 H9亚型禽流 感的病原的快速诊断和病毒的定量分析提供重要手段。 关键词：H9亚型禽流感病毒；HA基因；SYBRGreenI荧光定量PCR 中图分类号：$852．65 文献标识码 ：A DOI：10．3969／J．ISSN．1674—148X．2013．03．009 EstablishmentofSYBR Green IReal-timeRT—PCR Detecting H9Avian InfluenzaVirus XU Shouzhen。YIN Yanbo (CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine，QingdaoAgriculturalUniversity，Qingdao266109，China) Abstract：ConservativefragmentofHA geneofAIV (H9)wasamplified byRT—PCR andcloned into pMD18一T vector．Aftersequencing，thepositiverecombinantplasmidwasacquiredandusedtoestablish standardcurveoftheSYBR Green Ireal—timeRT-PCR．Theresultsshowedthatthesensitivitywasso goodthat74．3copies／~Loftheviruscontentcouldbedetected．Furthermore，thismethodwashighlyspe— cificandreproducible．Itisconcluded thattheSYBR GreenIreal—timeRT—PCR isagoodtechnologyfor pathogenicdiagnosisandvirusquantificationofAIV (H9)． Keywords：H9N2avianinfluenzavirus；HA gene；SYBR GreenIReal—timeRT—PCR 禽流感 (avianinfluenza，AI)是由于正黏病毒科 养禽生产造成的巨大影响和损失 ，如何快速准确地 流感病毒属 的A 型流感病毒 (AIV)引起 的一种禽 检测 AIV(H9)已成为防控的关键 。 类或人类感染的传染病 。根据AIV的血凝素(HA) 禽流感 AI(H9)与新城疫 (ND)、鸡传染性支气 和神经氨酸酶 (NA)抗原差异，AIV可分为 16个 管炎(IB)临床症状相似 ，给 AI(H9)的诊断造成 了 HA 亚 型 (H1～ H16)和 9个 NA 亚 型 (N1～ 极大困难。传统的病毒分离和血清学诊断方法费时 N9)口]。H9亚型 AIV(AIV(H9))于 1966年在美 费力 ，不利于 AIV(H9)的快速诊断 ；而 常规 RT— 国威斯康星在火鸡中首次发现，自1999年以来也出 PCR方法由于实验