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实验四 电泳技术 一、定义 带电颗粒在电场作用下向着与其电性相反的电极移动的现象，称为电泳。 带正电荷的粒子向负极移动，带负电荷的粒子向正极移动。 是生化与分子生物学的重要研究方法之一，可用于样品分离、物质纯度分析和分子量的测定等。 1.许多生物分子带有电荷，在电场中可以发生 移动。 2.每种分子迁移率不同，一定时间内在电场中 的迁移距离不同。 二、电泳迁移率 设一带电粒子在电场中所受的力为F，则 F = QE （Q为粒子所带电荷，E为电场强度） 根据Stoke定律，一球形分子在溶液中运动 所受的阻力f为： f = 6πrηv （v为分子移动速度；r为分子半径；η为介质 黏度） 当分子达到动态平衡时， F = f 即 QE= 6πrηv 移项得 v/E=Q/ 6πrη v/E:表示单位电场强度时粒子运动速度，称 为迁移率，也称电泳速度，以?表示。 因此上式也可表示为： ? = Q / 6πrη 三、影响迁移率的因素 1.电场强度（E） 电场强度是指每厘米的电位降。电泳速度与电场 强度成正比。电场强度越高电泳速度越快。 根据电场强度大小，电泳可分为： 常压电泳：2～10V/cm 高压电泳：20～200V/cm 2.溶液的pH值 pH值决定带电颗粒的解离程度，决定物质所带 净电荷的多少。选择合适pH，使混合物中各成分所 带电量差别较大。 pHpI带负电 pHpI带正电 3.溶液的离子强度 缓冲液的离子强度越高，电泳速度越慢 一般在0.02-0.2mol/L。 4.电渗现象 在电场中液体对固体支持物的相对移动。 电泳介质多孔，且带有可解离的化学基团， 吸附正离子或负离子，使溶液相对带电。 应尽量避免选用有电渗作用的支持物。 四、电泳的分类 按电泳的原理来分，可分为二类： 自由界面电泳：又称移动界面电泳，是指在没有支持介质的溶液中进行的电泳。其装置复杂，价格昂贵，费时费力，不便于推广应用。 区带电泳：是指有支持介质的电泳，待分离物质在支持介质上分离成若干区带。支持介质的作用主要是防止电泳过程中的对流和扩散，以使被分离的成分得到最大分辨率的分离。区带电泳由于采用的介质不同以及技术上的差异，又可分为不同的类型。 根据支持介质物理形状不同 （1）滤纸及其它纤维素薄膜电泳 （2）凝胶电泳 （3）粉末电泳 （4）线丝电泳 根据支持介质的装置形式 （1）平板式电泳 （2）垂直板式电泳 （3）连续式电泳 （4）圆盘电泳 根据pH连续性与否 （1）连续pH电泳 （2）非连续pH电泳 琼脂糖凝胶电泳：一般用于核酸的分离分析。 琼脂糖凝胶孔径度较大，对大部分蛋白质只有很 小的分子筛效应。 聚丙烯酰胺凝胶电泳：可用于核酸和蛋白质的 分离、纯化及检测。其分辨率较高。 聚丙烯酰胺和琼脂糖是目前实验室最常用的支持介质 五、琼脂糖凝胶电泳 特点 1.具有大量微孔 孔径大小取决于浓度：0.075%浓度孔径800nm 0.16%浓度孔径500nm 1%浓度孔径150nm 2.具有较高的机械强度 可以在1%或更低浓度下使用 3.无毒，不需要催化剂 4.具有热可逆性，低熔点琼脂糖回收样品容易 5. 胶凝温度34-43℃ 熔化温度75-90℃ 低熔点琼脂糖胶凝温度低于30℃(融化温度高于30 ℃) 电极缓冲液 TAE: 40mM/L Tris-醋酸 1mM/L EDTA 5×:24.2克Tris 5.7ml冰醋酸 10ml 0.5M/L EDTA TBE: 45mM/L Tris-硼酸 1mM/L EDTA 5×:54克Tris 27.5克硼酸 10ml 0.5M/L EDTA 琼脂糖凝胶电泳优点： 1.双重效应：电泳效应、分子筛效应。 2.操作简单，电泳速度快，样品无需预处理。 3.电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好。 4.凝胶透明且无紫外吸收，可在紫外灯下观看结果。 5.易染色，易洗脱，便于定量。 琼脂糖凝胶电泳一般用于核酸的分离分析。 琼脂糖凝胶分离范围 琼脂糖浓度% 线状DNA分子分离范围Kb 0.3 5-60 0.6 1-20