第四讲基因芯片技术.ppt

第四章 基因芯片技术 §1 生物芯片简介及分类 §2 基因芯片制备及应用 第一节 生物芯片简介及分类 一、生物芯片(biochip)的概念 指通过机器人自动印迹或光引导化学合成技术在硅片、玻璃、凝胶或尼龙膜上制造的生物分子微阵列，根据分子间的特异性相互作用的原理，将生命科学领域中不连续的分析过程集成于芯片表面，以实现对细胞、蛋白质、基因及其他生物组分的准确、快速、大信息量的检测。 生物芯片主要特点是高通量、微型化和自动化。 二、生物芯片的分类 (一)按载体材料分类 玻璃芯片、硅芯片、陶瓷芯片。 (二)按点样方式分类 原位合成芯片、微矩阵芯片、电定位芯片。 原位合成芯片：它将半导体中的光蚀刻技术运用到DNA合成化学中，以单核苷酸或其他生物大分子为底物，在玻璃晶片上原位合成寡核苷酸，从而制备成芯片。 微矩阵芯片：将用PCR或化学合成等方法得到的DNA或寡核苷酸片段用针点或喷点方法直接排列到玻片等载体，从而制备成芯片。特点是密度高、制作方便。 电定位芯片：是利用静电吸附的原理将DNA快速定位在硅基质、导电玻璃上，从而制备成芯片。特点是在电力推动下可使杂交快速进行，但制作工艺复杂，点样密度低。 (三)按芯片固定的生物分子类型分类 基因芯片、蛋白质芯片和芯片实验室 基因芯片技术(gene chip):就是将大量探针分子固定于支持物上，根据碱基互补配对原理，与标记的样品分子进行杂交，通过检测杂交信号的强度及分布进而获取样品中靶分子的数量和序列信息。 蛋白质芯片(protein chip):就是选择一种能够牢固地结合蛋白质分子(抗原或抗体)的固相载体，在上面按预先设计的方式固定大量蛋白质(抗原或抗体)，形成蛋白质的微阵列，然后加入与之特异性结合的带有特殊标记的蛋白质分子(抗原或抗体)，通过对标记物的检测来实现抗原抗体的互检。 芯片实验室(lab-on-chip):是将纳米技术引入生物芯片，在微小的硅材料表面，制造出能够对微量样品进行变性、分离、纯化、电泳、PCR扩增、加样及检测等微小结构，使过去一个实验的各个实验步骤微缩于一个芯片上,这种技术称为芯片实验室。 (四)按芯片的使用功能分类 测序芯片、表达谱芯片、基因差异表达分析芯片 第二节 基因芯片制作及应用 一、基因芯片技术的概念 就是将大量探针分子固定于支持物上，根据碱基互补配对原理，与标记的样品分子进行杂交，通过检测杂交信号的强度及分布进而获取样品中靶分子的数量和序列信息。 二、基因芯片的基本原理 基因芯片的工作原理与经典的核酸分子杂交方法(southern、northern)一致，应用已知核酸序列作为靶基因与互补的探针核苷酸序列杂交，通过随后的信号检测进行定性与定量分析。具体讲即是将许多特定的寡核苷酸片段或cDNA基因片段作为靶基因，有规律地排列固定于支持物上；样品DNA/RNA通过PCR扩增、体外转录等技术掺入荧光标记分子或放射性同位素作为探针；然后按碱基配对原理将两者进行杂交；再通过荧光或同位素检测系统对芯片进行扫描，由计算机系统对每一探针上的信号作出比较和检测，从而得出所需要的信息。 三、基因芯片的制备 基因芯片技术主要包括四个主要步骤：芯片制作、样品制备、分子杂交、信号检测与结果分析。 Comparison of DNA Chip Technology （一）芯片的制备 基因芯片种类较多，主要以玻璃片、硝酸纤维素膜或硅片为载体，制备方法基本上可分为两大类－原位合成和预合成后点样。 预合成后点样：是指制备芯片微阵列前，要固定的探针已经合成好，点样系统需要做的就是把这些合成好的样品涂在基体上。 原位合成：是指利用光导合成的方法在载体表面上逐个合成寡核苷酸，合成后点样可能将十几至几十个碱基的寡核苷酸或几百个碱基的cDNA片段固定到载体上制成寡核苷酸芯片或cDNA微阵列。 1 支持物的预处理 载体材料要求： ①载体表面必须具有可以进行化学反应的活性基团，以便与生物分子进行偶联。 ②使单位载体上结合的生物分子达到最佳容量。 ③载体应当是惰性的和有足够的稳定性，包括机械的、物理的和化学的稳定性。 惰性:是指载体的其他性能或特异性吸附都不应该干扰生物分子的功能。 稳定性:是指在进行分子杂交或结合时，可能遭受一定的压力或酸、碱条件而不发生变化。 支持物的预处理 实性材料：硅芯片、玻片和瓷片,需进行预处理,使其表面衍生出羟基、氨基活性基团。 膜性材料：聚丙烯膜、尼龙膜、硝酸纤维膜,通常包被氨基硅烷或多聚赖氨酸。 2 芯片的制作 目前常用的基因芯片制作方法：接触点样法、喷黑法、原位合成法。 接触点样法：是将样品直接点在基体上，其优点是仪器结构简单、容易研制，是一种快速、经济、多功能的仪器，可以在3.6cm2面积内点上10000个cDNA。不足之处是每个样品都必须